179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
179542 no-metán-hidroklorid pufferben szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót 1 :1 arányban 0,1 mólos 7,0 pH-jú bisz-(hidroxi-etil)-glicin-hidroklorid pufferrel hígítjuk. B. Kompetitiv kötési reakció biotin kimutatására, a biotin különböző mennyiségeinek hatása a felszabaduló umbelliferon mennyiségére. 8 specifikus kötési reakcióelegyet készítünk, mindegyik össztérfogata 0,2 ml, mindegyik 0,1 mólos 7,0 pH-jú bisz-(hidroxi-etil)-glicin-hidroklorid puffert, 0,3 mikromól biotin-umbelliferon konjugátot (a 11. példában ismertetett módon állítottuk elő), a példa A. részében előállított, avidint tartalmazó Sepharose 4B-szuszpenzióból 15 mikrolitert és a XII. táblázatban megadott mennyiségekben biotint tartalmaz. A reakcióelegyeket szobahőmérsékleten 20 percen át inkubáljuk enyhe rázás közben. Ezután mindegyik reakcióelegyet centrifugaijuk, majd a felülúszó fázisok 100-100 mikroliteres aliquotjaihoz 2 ml 0,1 mólos 8,2 pH-jú olyan bisz-(hidroxi-etil)-glicin- hidroklorid puffert adunk, amely 1,08 egység sertés-észterázt tartalmaz. 5 percen át tartó, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után minden egyes reakcióelegy által 448 nm-nél (ahol a lehetséges maximum van) mérhető fluoreszcens fénykibocsátást mérjük Amico-Bowman típusú spektrofotofluométeirel (a gerjesztést 364 nm-nél végezzük). A kapott eredményeket az alábbi XII. táblázatban adjuk meg. XII. táblázat 43 Reakcióelegy Biotin koncent- Fluoreszcencia sorszáma rációja (mikromól) intenzitása 1 0,00 0,355 2 0,10 0,495 3 0,20 0,469 4 0,30 0,503 5 0,40 0,547 6 0,50 0,502 7 0,75 0,580 8 1,00 0,688 Látható, hogy a folyadékbázisban az NAD-biotin ligandum mennyisége egyenesen arányos a jelenlevő szabad biotin mennyiségével, vagyis így a biotin mennyisége ismeretlen biotin koncentrációjú folyadékmintákban meghatározható. Ez a példa demonstrálja egy enzimszubsztrát használatát jelző részként specifikus kötésen alapuló kimutatási módszernél. Meghatározandó antigénként vagy hapténként a példában csak illusztratív jelleggel említettük a biotint, vagy a 2,4-dinitro-fenil-származékokat vagy az ezekre specifikus antitesteket. A módszer bármilyen antigén, vagy haptén kimutatására alkalmas, amelyhez kémiai úton egy előre meghatározott kémia reakció reaktánsa jelző anyagként hozzáköthető. Jelzőrészként használhatunk megfelelően kimutatható koenzimeket (az ismertetésre került 2., 3., 8. és 12. példákban említett NAD és ATP koenzimeken túlmenően), enzimszubsztrátokat (az ismertetésre került 5. és 13. példákban említett 22 fluoreszceinben és umbelliferonban levő észterkötéseken túlmenően), ciklusos kémiai reakcióban részt vevő reaktánsokat (az ismertetésre került 2. példában említett NAD—NADH rendszeren túlmenően) és kemilumineszcens reakciókban részt vevő reaktánsokat (az ismertetésre került 3., 8., 10. és 12. példákban említett ATP-n, izoluminolon és NAD-n túlmenően). Megjegyezzük, hogy az ismertetésre került 2., 3., 5., 8., 10., 12. és 13. példákban leírt kimutatási módszerek megismételhetők különböző, 25 : 75—75 : 25 súlyarányok között változó értékű jelzett antigén vagy haptén : antitest vagy kötő fehérje arányok tartásával olyan standard görbéket kapva, amelyek alapján kvantitatív kimutatási módszerek hajthatók végre. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás egy specifikus kötésen alapuló, heterogén vagy homogén típusú kimutatási módszerre vizes közegben egy antigén illetve egy haptén kimutatására, amelynek során (i) a vizes közegben az antigént illetve a haptént vagy annak egy jelzőanyaggal alkotott vegyületével és az antigén illetve haptén specifikus kötőpartnerével (antitesttel vagy más kötőképes fehérjével) vagy az antigén illetve haptén specifikus kötőpartnerének (antitestnek vagy más kötőképes fehérjének) jelzőanyaggal alkotott vegyületével reagáltatjuk, az így létrejövő specifikus kötési reakciórendszerben egy kötött fázist és egy szabad fázist hozunk létre, amikor is a kötött fázisban vagy a szabad fázisban jelentkező aktív jelzőanyag mennyisége a vizsgált vizes közegben levő antigén illetve haptén mennyiségétől függ, majd (ii) adott inkubációs idő után a kötött vagy a szabad fázisban a jelzett antigénnel, illetve hapténnel vagy a hozzájuk tartozó specifikus kötőpartnerrel (antitesttel vagy más kötőképes fehérjével) kémiailag kötött jelzőanyag aktivitását meghatározzuk azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben jelzett antigénként illetve hapténként vagy specifikus kötőpartnerükként olyan antigént illetve haptént vagy specifikus kötőpartnert használunk, amely kémiai kötéssel képes kapcsolódni egy jelzőanyagként használt koenzimhez, enzimszubsztráthoz, ciklusos kémiai reakcióban részt vevő reaktánshoz, fluoreszcens vagy kemolumineszcens reakcióban részt vevő reaktánshoz, továbbá az (ii) lépés végrehajtásaként egy előre kiválasztott reakcióban koenzimaktivitást, enzimszubsztrát-aktivitást, egy előre kiválasztott ciklusos kémiai reakcióban a jelző részként használt reaktáns aktivitását, egy előre kiválasztott fluoreszcens vagy kemolumineszcens reakcióban a jelző részként használt reaktáns aktivitását határozzuk meg. 2. Az 1. igénypont szerinti homogén típusú kimutatási módszer foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy olyan jelző részt használunk, amelynek aktivitása a kötött fázisban mérhetően eltérő a szabad •fázisban mérhető aktivitástól, miáltal az (ii) lépésben a két fázis fizikai elválasztása egymástól nem lényeges. 3. Az 1. igénypont szerinti heterogén típusú kimutatási módszer foganatosítási módja, azzal jellemezve, 44 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
