179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
179542 36 8. példa Homogén kompetitiv kötési-biolumineszcens kimutatási módszer 2,4-dinitro-fenil-származékok meghatározására, ATP alkalmazása jelzőanyagként. Az ebben a példában alkalmazott biolumineszcens reakció rendszer az alábbi reakción alapul: ATP-ligandum + redukált luciferin luciferáz----------► AMP-ligandum + oxidált luciferin * hv A. Kimutatási módszer ATP 6-helyzetű származékát használva. 3 specifikus kötési reakcióelegyet készítünk, mindegyik össztérfogata 100 mikroliter és mindegyik 10 millimól trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-hid roklorid puffert (pH-ja 7,4), 10 millimól etiléndiamintetraecetsavat, 20 mikroliter 2,4-dinitro-fenilcsoportra specifikus antiszérumot, 512 nanomól 2,4-dinitrofenil-ATP konjugátot (6-helyzetű származék, a 6. példában ismertetett módon állítottuk elő) és az alábbi VII. táblázatban jelzett mennyiségekben 2,4-dinitro-fenil-ß-alanint tartalmaz. 25 °C-on 2 órán át végzett inkubálás után mindegyik reakcióelegyből kétszer 10-10 mikroliteres aliquotokát vizsgálunk úgy, hogy az aliquotokat a korábban ismertetett (3. példa) összetételű fényt kibocsátó oldat előzetesen 25 °C-on legalább 2 percen át inkubált és Dupont Model 760 Bioluminescence Photometer márkanevű fotométer (szállítója az E. I. duPont de Nemours, Wilmington, Delaware állam, amerikai egyesült államokbeli cég) kísérleti küvettájába töltött 0,1 ml-nyi térfogatú mennyiségébe injektáljuk. A kibocsátott fényintenzitás csúcsát a fotométerrel mérjük. Kiszámítjuk ezután minden egyes reakcióelegyre az átlagos maximális fényintenzitást. A kapott eredményeket az alábbi VII. táblázatban adjuk meg. 35 VII. táblázat Reakció-2,4-dinitro-fenil-Átlagos elegy-j3-alanin koncentmaximális sorszáma rációja (mikrontól) fényintenzitás 1 0 7 2 25 14 3 2500 185 B. Kimutatási módszer ATP 8-helyzetű származékát használva. 4 specifikus kötési reakcióelegyet készítünk, mindegyik össztérfogata 100 mikroliter és mindegyik 20 millimól trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid puffert (pH-ja 7,4), 10 millimól etiléndiamintetraecetsavat, 20 mikroliter, 2,4-dinitrofenilcsoportra specifikus antiszérumot, 594 nanomól 2,4-dinitro-fenil-ATP konjugátot (8-helyzetű származék, a 7. példában ismertetett módon állítottuk elő) és az alábbi VIII. táblázatban jelzett mennyiségekben 2,4-dinitro-fenil-d-alanint tartalmaz. 25 °C-on 2 órán át végzett inkubálás után minden egyes reakcióelegyből kétszer 10—10 mikroliter aliquotokat veszünk és ezeket a példa A. részében ismertetett módon vizsgáljuk, majd az ugyanitt ismertetett módon az átlagos maximális fényintenzitást kiszámoljuk. A kapott eredményeket az alábbi VIII. táblázatban adjuk meg. VIII. táblázat Reakcióelegy sorszáma 2,4-dinitro-fenil-(3-alanin koncentrációja (mikromól) Átlagos maximális fényintenzitás 1 0 18 2 25 51 3 250 191 4 2500 190 A példa eredményeiből látható, hogy a jelzőanyagként használt ATP-bői különböző helyzetű származékok készíthetők, és ezek felhasználhatók olyan hasznos konjugátok előállításában, amelyek a találmány szerinti specifikus kötéses kimutatási módszerhez hasznosíthatók. Ez a példa demonstrálja egy kemilumineszcensen mérhető koenzim használatát jelző részként specifikus kötésen alapuló kimutatási módszernél. 9. példa Biotin-izoluminol konjugát, pontosabban 6-(3-biotinoil-2-hidroxi-propil-amino)-2,3-dihidro-ftálazin-l ,4- -dion előállítása A. 4-(3-Klór-2-hidroxi-propil-amino)-N-metil-ftálimid. 150 ml 2,2,2-trifluor-etanolhoz a J. Chem. Soc., 26, (1937) irodalmi helyen ismertetett módszerrel előállítható 4-amino-N-metil-ftálimidból 25 g-ot (0,142 mól), valamint 20,7 g (0,21 mól) l-klór-2,3- -epoxi-propánt adunk, majd a kapott reakcióelegyet keverés közben visszafolyató hűtő alkalmazásával 48 órán át forraljuk. Ezután 70-80 ml 2,2,2-trifluor-etanolt ledesztillálunk, majd a maradék oldatot szobahőmérsékletre hűtjük, amikor is durvaszemcséjű sárga csapadék válik ki. Ezt a csapadékot kiszűrése után etil-acetáttal eldörzsöljük, majd kiszűrjük és szárítjuk, így 29,5 g (77%) mennyiségben a 136-138,5 °C olvadáspontú cím szerinti köztiterméket kapjuk. Elemzési eredmények a Ci2H13C1N203 képlet alapján: számított: C =53,64%, H =4,88%, H = 10,45%, talált: C = 53,87%, H =4,85%, N = 10,81%. B. 4-[3-(N-Ftálimido)-2-hidroxi-propil-amino]-N-metil-ftálimid. Keverés közben az A. részben kapott köztitermékből 13,5 g (0,05 mól) és 15,7 g (0,085 mól) ftálimid-kálium 150 ml dimetil-formamiddal készült oldatát visszafolyató hűtő alkalmazásával 24 órán át forral5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
