179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
179542 38 juk, majd a dimetil-formamidot lehajtjuk és a maradékot vízzel mossuk, majd szűrjük. A kapott sárga színű szűrőlepényt ecetsav és víz elegyéből átkristályosítjuk, amikor is 12,8 g (67%) mennyiségben a 247 —248,5 °C olvadáspontú cím szerinti köztiterméket kapjuk. Elemzési eredmények aC2oH12N305 képlet alapján: számított: C =63,32%, H =4,52%, N = 11,08%, talált: C =63,16%, H =4,38%, N = 10,93%. C. 6-(3-Amino-2-hidroxi-propil-amino)-2,3-dihidro-ftálazin-l,4-dion. Keverés közben a B. lépésben kapott köztitermékből 5,0 g (13,2 millimól), 90 ml abszolút etanol és 35 ml 95%-os hidrazin keverékét visszafolyató hűtő alkalmazásával 4 órán át forraljuk, majd az oldószert vákuumban lehajtjuk és a kapott csapadékot vákuumban 120°C-on 24 órán át szárítjuk. Az így kapott anyagot ezután 1 órán át 70 ml 0,1 normál sósavoldattal keverjük, majd az oldhatatlan 2,3-dihidroxi-ftálazin-1,4-diont szűrés útján eltávolítjuk és a szűrlet pH-ját telített nátrium-hidr(%én-karbonát-oldat adagolása útján 6,5-re beállítjuk. Az ekkor kiváló fehér csapadékot kiszűrjük, majd szárítjuk. Így 2,2 g (67%) terméket kapunk. Vízből végzett átkristályosítása után olvadáspontja 273 “C. Elemzési eredmények aC) iH14N403 képlet alapján: számított: C = 52,79%, H =5,64%, N = 22,39%, talált: C = 52,73%, H =5,72%, N =22,54%. D. Biotin-izoluminol konjugát Vízmentes körülmények között 20 ml vízmentes dimetil-formamidban feloldunk 0,29 g (1,2 millimól) biotint és 0,17 ml trietil-amint, majd a kapott oldatot —10 °C-ra hűtjük. Az oldathoz ezután lassan hozzáadjuk 0,141 ml klórhangyasav-etilészter 2,86 ml dietiléterrel készült oldatát, majd a kapott reakcióelegyet 30 percen át keverjük. Az ekkor kiváló csapadékot kiszűrjük, a szűrlethez pedig gyorsan hozzáadjuk a C. lépésben kapott köztitermékből 600 mg (2,4 millimól) 20 ml vízmentes dimetil-formamid és 1 ml vízmentes piridin elegyével képzett szuszpenzióját. A reakcióelegyet ezután —10°C-on 30 percen át, majd szobahőmérsékleten 1 éjszakán át keverjük. így egy oldatot kapunk, amelyből 60 °C-on végzett desztillálással (0,1 torr nyomáson) a dimetil-formamidot eltávolítjuk. Az olajos maradékot ezután 50 ml 0,1 normál sósavoldattal keverjük 1 órán át, majd a képződött fehér csapadékot kiszűrjük, ezután pedig 0,1 normál sósavoldattal és vízzel mossuk. Vákuumban szobahőmérsékleten egy éjszakán át végzett szárítás után 0,55 g (97%) cím szerinti vegyületet kapunk, amelynek olvadáspontja 170-173 °C. Elemzési eredmények a C21H28N605S képlet alapján: 37 számított: C = 52,92%, H = 5,92%, N = 17,64%, alált: C = 51,69%, H = 5,90%, N = 17,63%. 10. példa Homogén kompetitiv kötési-kemilumineszcens kimutatási módszer biotin meghatározására. Az ebben a példában használt kemilumineszcens reakciórendszer az alábbi kémiai reakción alapul: biotin-izoluminol + K02 -----------------► biotin-aminoftalát + N2 + hn 16 specifikus kötési reakcióelegyet készítünk, mindegyik össztérfogata 150 mikroliter és mindegyik 0,1 mól trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid puffert (pH-ja 8,0), 42 nanomól biotin-izoluminol konjugátot (a 9. példában ismertetett módon állítottuk elő), a IX. táblázatban jelzett mennyiségű biotint 'es 0,12 egység/ml koncentrációban avidint (utoljára adagoljuk) tartalmaz. 25 °C-on 5 percen át végzett inkubálás után mindegyik reakcióelegyhez 10-10 mikroliter olyan dimetil-formamidos oldatot injektálunk, amely 0,15 mól kálium- peroxidot (K02, szállítója az Alpha Products, Beverly, Massachusetts állam, amerikai egyesült államokbeli cég) és 0,10 mól 1,4,7,10,13,16-hexaoxaciklooktadekánt (szállítója az Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin állam, amerikai egyesült államokbeli cég) tartalmaz. 25 °C-on további 2 percen át végzett inkubálás után minden egyes reakcióelegyhez hidrogén-peroxid 10 millimólos trisz-{hidroxi-metil)-amino-metán-hídroklorid pufferrel (pH-ja 7,4) készült, 0,95 millimólos oldatából 10—10 mikrolitert injektálunk, majd az egyes reakcióelegyek által kibocsátott maximális fényintenzitást a 8. példában ismertetett fotométerrel meghatározzuk. A kapott eredményeket az alábbi IX. táblázatban adjuk meg. IX. táblázat Reakcióelegy sorszáma Biotin koncentrációja (nanomól) Maximális fényintenzitás 1 0 38,5 2 13 38,5 3 27 34,3 4 40 36,1 5 53 35,2 6 67 36,2 7 101 34,0 8 133 31,7 9 166 29,1 10 200 24,2 11 267 22,8 12 333 20,5 13 400 13,4 14 534 8,6 15 667 8,3 16 800 7,0 5 10 15 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 65 19
