179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
33 179542 34 mal a kívánt célvegyületet, azaz konjugátot kapjuk, amely elemzésének tanúsága szerint valóban egy ribózegységre három egység foszfátcsoportot tartalmaz. 7. példa 8-[ 2-(2,4-Dinitro-fenil)-amino-etil] -amino-adenozin-5 ’-trifoszfát. A) 8-[ 2-Amino-etií)-amino-adenozin-5’--monofoszfát. 2,2 millimól 8-bróm-adenozin-5’-monofoszfát [előállítható az Arch. Biochem. Biophys., 163, 561—569 (1974) irodalmi helyen ismertetett módszerrel], 66 millimól etiléndiamin és 25 ml víz elegyét 140 °C hőmérsékletű olajfürdőben 2 órán át hevítjük, majd lehűtjük, pH-ját nátrium-hidroxiddal 11,5-re beállítjuk és felvisszük Dowex 1x8 márkanevű gyantából (200—400 mesh szemcseméretű, hidrogénkarbonát-formájú) készült 2,5 x 55 cm méretű oszlopra. Az oszlopot ezután 300 ml vízzel mossuk, majd 3 liter viz és 3 liter 0,5 mólos ammónium-hidrogén-karbonát-oldat elegyével lineáris gradiens-eluálásnak vetjük alá. Az oszlopot elhagyó folyadék abszorpcióját 254 nm-nél folyamatosan mérjük. 4,6 és 5,8 liter eluátumtérfogat között nagy mennyiségű abszorbeáló anyag eluálódik. Az eluátumnak ezt a frakcióját bepároljuk, majd az am mó niu m -hi d rögén -ka rb o ná to t vákuumban végzett ismételt bepárlás (ötszöri bepárlás, egy-egy bepárláshoz 20—30 ml vizet alkalmazunk) útján eltávolítjuk, a végső maradékot pedig 20 ml vízben oldjuk pH 8,0 értékig ammónium-hidroxid-oldat adagolásával. Az így kapott oldatot szüljük, majd pH-ját hangyasavval 5,0-ra beállítjuk és ezután egy napon át 5 °C-on állni hagyjuk. Az ekkor kivált kristályokat kiszűrjük, 8,0 pH-jú vízben újraoldjuk és 5,0 pH-jú vízben kristályosodni hagyjuk. Az így kapott termék hozama 27%. 4 rész 0,5 mólos ammónium-acetát-oldat és 1 rész etanol elegyét mint futtatószert használva végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során a vegyidet egyetlen, ninhidrinre pozitív foltként vándorol, és a folt ugyanakkor fluoreszcens is. A termék optikai abszorpciós maximuma 0,02 normál sósavoldatban 275 nm-nél van és a millimoláris extinkciós koefficiens 17,5, amely spektrális jellemzők az alkilezett 8-amino-adenozin-származékokra jellegzetesek. Elemzési eredmények a Ci 2,H20N7O7P* H20 képlet alapján: számított: C =34,0%, H =5,33%, N =23,2%, talált: C =34,1%, H =5,28%, N =23,9%. B. 8-[2-(2,4-Dinitro-fenil)-amino-etil]-amino-adenozin-5’-monofoszfát. Az A. lépésben kapott vegyületből 0,64 millimólt feloldunk 20 ml vízben pH 8,0-ig nátrium-hidroxid adagolása útján. Ezután a kapott oldathoz 168 mg nátrium-hidrogén-karbonátot, majd 0,2 ml 1-fluor-2,4-dinitro-benzol (1,58 millimól) 2 ml etanollal készült oldatát adjuk. A kapott reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten 18 órán át keverjük, majd 0,1 ml l-fluor-2,4-dinitro-benzol 1 ml etanollal készült oldatát adjuk hozzá. További 4 órán át tartó keverés után a reakcióelegy pH-ját sósavoldattal 2,0-ra beállítjuk, majd a reakcióelegyet 200 ml —10°C-os acetonba öntjük. A képződött sárga csapadékot kiszűrjük, majd 200 ml vízben feloldjuk és az így kapott oldatot felvisszük hidrogénkarbonát-formájú DEAE-cellulózból készült, 2,5 x 45 cm méretű oszlopra. Az oszlopot ezután 2 liter víz és 2 liter 0,7 mólos ammónium-karbonát-oldat elegyével lineáris gradiens-eluálásnak vetjük alá. 2 és 3 liter eluátumtérfogat között 275 nm-nél optikai abszorpciós maximumot mutató anyag eluálódik. Ezt az eluátumrészt bepároijuk, majd az ammónium-hidrogén-karbonátot vákuumban végzett ismételt bepárlás útján az anyagból eltávolítjuk. így a kívánt cím szerinti vegyületet kapjuk 37%-os hozammal 0,02 normál sósavoldatban mért optikai abszorpciós maximuma 275 és 363 nm-nél van, míg a millimoláris extinkciós koefficiens értéke 21,8, illetve 15,5. További elemzések tanúsága szerint egy egység ribozidra 1,07 egység foszfátcsoportot tartalmaz a molekula. C. 8-[ 2-(2,4-Dinitro-fenil)-amino-etil]--amino-adenozin-5’-trifoszfát. Az előző lépésben kapott monofoszfát köztitermék 0,5 millimólját tri-(n-butil)-ammóniumsóvá alakítjuk 0,8 millimól tri-(n-butil)-amin adagolása útján. A kapott elegyet ezután vízmentes dimetil-formamidból (négyszer 10-15 ml) végzett ismételt bepárlás útján szárítjuk, majd a végső maradékot feloldjuk 1 ml dime til-formamidb an és az így kapott oldatot össze keveijiik 2,0 millimól karbonil-diimidazol 1 ml dimetil-formamiddal készült oldatával. Az így kapott reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten 4 órán át állni hagyjuk, majd a fölöslegben levő karbonil-diimidazolt 15 mikroliter metanol adagolása útján (az elegyet a metanollal 30 percen át állni hagyjuk) elbontjuk. Végül a reakcióelegyhez 3 millimól tri-(n-butil)-ammónium-pirofoszfát 4 ml dimetil-formamiddal készült oldatát adjuk, majd a reakcióelegyet 20 órán át állni hagyjuk. A képződött szilárd anyagot ezután centrifugális útján elkülönítjük, majd kétszer 5-5 ml dimetil-formamiddal mossuk. Az egyesített felülúszó fázishoz 200 ml vizet adunk, majd a vizes elegy pH-ját 8,0-ra beállítjuk és a vizes elegyet ezután felvisszük hidrogénkarbonát-formájú DEAE-cellulózzal töltött, 2,5 x 25 cm méretű oszlopra. Az oszlopot 2 liter víz és 2 liter 0,5 mólos ammónium-hidrogén-karbonit-oldat elegyével lineáris gradiens-eluálásnak vetjük alá, 2,0 és 2,9 liter eluátumtérfogat között 275 és 363 nm-nél optikai abszorpciós maximumot mutató, sárga anyag eluálódik. Ezt az eluátumfrakcióribepároljuk, majd az ammónium-hidrogén-karbonátot ismételt bepárlás útján eltávolítjuk. így 22%-os hozammal a kívánt cím szerinti vegyületet, illetve konjugátol kapjuk. Elemzési eredményeinek tanúsága szerint 1 egység ribózra molekulája 3,2 egységnyi foszfátcsoportot tartalmaz. 17 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 r
