179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
31 179542 32 latátjelző részként specifikus kötésen alapuló kimutatási módszernél.) 6. példa N6-[2-(2,4-Dinitro-fenil)-amino-etil]-adenozin-5’-trifoszfát előállítása. A. N6 -(2-amino-etil)-adenozin-5’-monofoszfát. 2 g (7 millimól) 6-klór-purin-ribozidot (szálb'tja a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri állam, amerikai egyesült államokbeli cég) 17 ml trietil-foszfáttal keverünk, illetve foszforoxi-kloriddal reagáltatunk víz jelenlétében a Chem. Scrip., 19, 165-170(1972) irodalmi helyen ismertetett módszerrel. A kapott foszforsavészter-klorid hidrolizálása után a reakcióelegyhez 9,5 ml etiléndiamint (140 millimól) adunk, majd a reakcióele gyet szobahőmérsékleten 3 órán át állni hagyjuk. Ezután a reakcióelegyet 4 liter vízzel hígítjuk, majd a vizes elegy pH-ját nátrium-hidroxiddal 12-re beállítjuk. A kapott lúgos kémhatású oldatot ezután átbocsátjuk acetát-formájú, Dowex 1x8 márkanevű gyantából (szállítója a Bio-Rad Laboratories, Richmond, California állam, amerikai egyesült államokbeli cég) készült, 5 x 30 cm méretű oszlopon. Ezután az oszlopot 3 liter 0,01 mólos ammónium-klorid-oldattal mossuk, majd 3 liter víz és 3 liter 1 mólos ecetsavoldat elegyével lineáris gradiens-eluálást végzünk. Ibolyántúli fényt abszorbeáló anyag eluálódik a spektrumban megjelenő elkülönült csúcs tanúsága szerint 1800 ml és 2050 ml eluátumtérfogat között, így az eluátum ezen részét vákuumban közel 25 ml-re bepároljuk. Ezután az így kapott koncentrátumot 7 °C-on egy éjszakán át állni hagyjuk, amikor is fehér kristályok válnak ki, amelyeket kiszűrünk és szárítunk. így 65%-os hozammal kapjuk a cím szerinti terméket. A termékből vett mintát elemzési célokból forró vízből átkristályosítjuk. Elemzési eredmények a Ci 2Hi9N607P • 2H20 képlet alapján: számított: C =33,8%, H =5,45%, N = 19,7%, talált: C =34,3%, H =5,22%, N = 19,7%. Kétféle futtatószerrel ugyanakkor vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat végzünk. Az egyik futtatószer 4 rész 0,5 mólos ammónium-acetát-oldat és 1 rész etanol elegye, míg a másik 3 rész izovajsavból és 5 rész 1 mólos ammónium-hidroxid-oldatból áll. Mindkét futtatószerrel egyetlen folt mutatható ki, amely fluoreszcens és ninhidrinnel reagál. A termék abszorpciós maximuma 0,1 normál sósavoldatban vizsgálva 264 nanométernél van és a millimoláris extinkciós koefficiens 17,7, amely spektrális jellemzők az N6-alkilezett adenozin-származékokra jellemzőek. B. N6-[2-(2,4-Dinitro-fenil)-amino-etil]-adenozin-5’-monofoszfát. A példa A. lépésében kapott vegyületből 250mg-ot feloldunk 20 ml 8-as pH-jú vízben, majd a 16 kapott oldathoz 168 mg nátrium-hidrogén-karbonátot és ezután 0,2 ml l-fluor-2,4-dinitro-benzolt (1,58 millimól, feloldva 2 ml etanolban) adunk. A kapott reakcióelegyet fénytől elzárt helyen szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük és ezután még 0,1 ml 1-fluor-2,4-dinitro-benzol 1 ml etanollal készült oldatát adagoljuk. Ezt követően a reakcióelegyet 1 éjszakán át keverjük, majd pH-ját sósavoldattal 2,0-ra beállítjuk és 200 ml etanolba öntjük. A kivált csapadékot kiszűrése után 200 ml vízben feloldjuk, majd a kapott vizes oldat pH-ját nátrium-hidroxiddal 8,0-ra beállítjuk, és a vizes oldatot ezután hidrogénkarbonát-formájú DEAE-cellulózból (szállítja a Reeve Angel, Clifton, New Jersey állam, amerikai egyesült államokbeli cég) készült, 2,5 x 30 cm méretű oszlopon átbocsátjuk. Ezután lineáris gradiens-eluálást végzünk 1,5 liter víz és 1,5 liter 0,7 mólos ammónium-hidrogén-karbonát-oldat elegyével. A gradiens 1200ml-je és 1500ml-je között ibolyántúli fényt abszorbeáló sárga anyag nagyobb mennyisége eluálódik. Ezután az eluátumnak ezt a frakcióját bepároljuk, majd az ammónium-hidrogén-karbonátot ismételt szárazra párlás útján eltávolítjuk, amikor is 40%-os hozammal a kívánt célterméket kapjuk. A termék továbbá egyetlen sárga foltként vándorol a példa A. részében említett futtatószerekkel végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok során, továbbá 0,25 mólos nátrium-acetát — ecetsav pufferrel (pH-ja: 5,0) előhívott epiklórhidrintrietanolamin-anioncserélőpapíron. A termék 0,02 normál sósavoldatban 264 nm-nél és 363 nm-nél mutat maximális optikai abszorpciót, amikor is a millimoláris extinkciós koefficiensek értéke 21,8, illetve 14,2. C. N6 -[2-(2,4-Dinitro-fenil)-amino-etil]-adenozin-5'-trifoszfát. A példa B. lépésében kapott vegyületből 0,03 millimólt piridiniumsóvá konvertálunk piridinium-formájú Dowex 50 x 2 márkanevű gyantából (szállítója a Bio-Rad Laboratories, Richmond, California állam, amerikai egyesült államokbeli cég) készült, 1,5 x 20 cm méretű oszlopon végzett kromatografálás útján. Az oszlopot elhagyó sárga folyadékot szárazra pároljuk, majd 15 ml dimetil-formamidot és 0,3 millimól tri-(n-butil)-amint adunk hozzá. Az így kapott elegyet ezután szintén szárazra pároljuk, majd a kapott maradékot szárítjuk ismételt bepárlás útján. A monofoszfát köztiterméket ezután a J. Amer. Chem. Soc., 87, 1785-1788 (1965) irodalmi helyen ismertetett módszerrel a megfelelő trifoszfát végtermékké alakítjuk. A reakció során kapott, dimetil-formamidban oldható reakcióterméket ezután 250 ml vízhez adjuk, majd a kapott vizes oldat pH-ját 8,0-ra beállítjuk. Az így kapott oldatot ezután hidrogénkarbonát-formájú DEAE-cellulózból (dietilaminoetil-cellulózból) készült, 2,5 x 58 cm méretű oszlopon átbocsátjuk, majd az oszlopot 3 liter víz és 3 liter 0,5 mólos ammónium-karbonát-oldat elegyével gradiens-eluálásnak vetjük alá. Az először eluálódó csúcs — amelyből sárga anyag különíthető el - a difoszfát-származékként azonosítható. A gradiens 4,15 és 4,4 litere között eluálódó második csúcs — amely szintén sárga anyagot ad — szárazra párlása útján 20%-os hozam-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
