179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
29 IV. táblázat 179542 30 V. táblázat Reakció sorszáma 2,4-dinitro-fenil-0--alanin koncentrációja (nanomól) Reakciósebesség Reakciósebesség százalékos aránya az 1. reakciósebességéhez képest 1 0 2,78 — 2 0 1,04 37 3 5 1,01 36 4 10 1,04 37 5 20 1,24 45 6 30 1,51 54 7 50 1,54 56 8 75 1,80 65 9 100 1,85 67 10 150 2,33 84 A fenti táblázat eredményei világosan megmutatják, hogy a hidrolízises reakció sebessége egyenesen arányos a reakcióelegyben jelenlevő 2,4-dinitro-fenil-0-alanin mennyiségével. A találmány tehát kompozíciót és eljárást biztosít olyan ligandumok mint a 2,4-dinitro-fenil-származékok kimutatására kompetitiv kötési-fluoreszcens kimutatási módszerrel. C. Homogén kompetitiv kötési-spektrofotometriás kimutatási módszer 2,4-dinitro-fenil-származékok meghatározására, a 2,4-dinitro-fenil-ß-alanin különböző koncentrációinak hatása a reakciósebességre. 8 specifikus kötési reakcióelegyet állítunk elő, mindegyik össztérfogata 1,0 ml és mindegyik tartalmaz 0,1 mólos trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid puffert (pH-ja 7,0) és az V. táblázatban megadott mennyiségekben 2,4-dinitro-fenil-ß-alanint. Az V. táblázatban említett 8 reakcióelegy közül a 2-8. sorszámúakhoz 2,4-dinitro-fenilcsoportra specifikus antiszérumot adunk a másik elegyben, vagyis az 1. számú reakcióelegyben végbemenő, az észteráz enzim által katalizált reakció sebességének 82%-kal való csökkentésére. Alapos összekeverés után a reakcióelegyekhez még a 4. példában ismertetett módon előállított 2,4-dinitro-fenil-fluoreszcein konjugát dimetil-szulfoxiddal készült 0,1 millimólos oldatából 10—10 mikrolitert, majd 20—20 mikroliter olyan 0,1 mólos trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán- hidroklorid puffert (pH-ja 7,0) adunk, amely 2,16 nemzetközi egység úgynevezett „Type I” észteráz enzimet (E. C. No. 3.1.1.1, szállítja a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri állam, amerikai egyesült államokbeli cég) tartalmaz. Minden egyes reakcióelegyben az abszorpcióban 489 nm-nél mérhető, 1 perc alatt bekövetkező változást Gilford 2000 típusú spektrofotométerrel rögzítünk. A kapott eredményeket az alábbi V. táblázatban adjuk meg. Az V. táblázat eredményeiből látható, hogy a reakciósebesség egyenesen arányos a 2,4-dinitro-fenil-0-alaninnak a reakcióelegyben mérhető koncentrációjával. így tehát ezzel a módszerrel is kimutathatók olyan ligandumok, mint a 2,4-dinitro-fenil-származékok. Reakcióelegy sorszáma 2,4-dinitro-fenil-0-alanin koncentrációja (mikrontól) Abszorpcióváltozás sebesség 1 0 0,0261 2 0 0,0047 3 1,25 0,0118 4 2,5 0,0131 5 5,0 0,0185 6 7,5 0,0202 7 10,0 0,0192 8 12,5 0,0223 D. Homogén kompetitiv kötési-fluoreszcens kimutatási módszer 2,4-dinitro-fenil-származékok meghatározására, nem-enzimatikus követési reakció alkalmazása. Itt is az A reakcióvázlatban ábrázolt specifikus kötési reakciórendszert használjuk azzal a különbséggel, hogy nem használunk észteráz enzimet a konjugátban levő észterkötés hidrolízisének katalizál ására. 8 specifikus kötési reakcióelegyet készítünk, mindegyik össztérfogata 2 ml és mindegyik 0,1 mólos trisz-(hidroxi-metilj-amino-metán-hidroklorid puffert (7,5 pH-jú), valamint a VI. táblázatban megadott mennyiségekben 2,4-dinitro-fenil-$-alanint tartalmaz. Mindegyik reakcióelegyhez ezután 2,4-dinitro-fenilcsoportra specifikus antiszérumból 50-50 mikrolitert, majd alapos összekeverés után a 4. példában ismertetett módon előállított 2,4-dinitro-fenil- fluoreszcein konjugát dimetil-szulfoxidos 2 mikromólos oldatából 20—20 mikrolitert adunk. Az ekkor kialakuló reakciósebességet a példa A. részében ismertetett módon mérjük és az alábbi VI. táblázatban adjuk meg. VI. táblázat Reakció- 2,4-dinitro-fenilelegy sorszáma-ß-alanin koncentrációja (nanomól) Reakciósebesség 1 0 0,96 2 12,5 0,94 3 31,2 0,84 4 62,5 0,78 5 94,0 0,70 6 125 0,59 7 187 0,57 8 250 0,53 A táblázat eredményeiből látható, hogy a hidrolizálási bázissebesség észteráz távollétében fordítva arányos a 2,4-dinitro-fenil-(3-alaninnak a reakcióelegyben mérhető koncentrációjával. A találmány tehát kompozíciót és eljárást biztosít ligandumok, például 2,4-dinitro-fenil-származékok jelenlétének kimutatására folyékony közegben kompetitiv kötési-fluoreszcens kimutatási technikát alkalmazva, ahol a specifikus kötőpartner — miután a ligandumhoz lett kötve egy konjugátban - részt vesz a követési reakcióban. (Ez a példa demonstrálja egy enzimszubsztrát haszná5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
