179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
179542 nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között. A szerves fázist ezután elválasztjuk, majd 1%-os vizes kénsavoldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk és bepároljuk. A kapott vörös színű olajat 60 g szilikagélen (az E. Merck, Darmstadt, NSZK-beli cég „Silica gel 60”i márkanevű terméke) kromatografáljuk eluálószerként 20 térfogat% aceton és 80 térfogati szén-tetraklorid elegyét használva. A kapott 1,2 g-nyi nyers diésztert ezután 60 g szilikagélen újra kromatografáljuk eluálószerként 10 térfogati aceton és 90 térfogati szén-tetraklorid elegyét használva. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd bepároljuk, amikor is 180 mg mennyiségben a cím szerinti vegyületet kapjuk sárga üveges csapadék formájában. Elemzési eredmények a C44H3gN60i5 képlet 27 alapján: számított: C = 59,33%, H =4,30%, N ' = 9,43%, talált: C = 60,92%, H =4,35%, N = 9,65%. A vegyület infravörös spektroszkópiai vizsgálatának tanúsága szerint 1765 cm"1 -nél észtercsoport karbonilcsoportjára jellemző abszorpciós sáv észlelhető. 5. példa Ebben a példában homogén specifikus kötési kimutatási rendszert mutatunk be, amelynek esetében 2,4-dinitro-fenil-származékok és ezek antitestjei határozhatók meg jelzőanyagként egy enzimszubsztrátot, éspedig modifikált fluoreszceint használva. A példában hasznosított specifikus kötési rendszert az A reakcióvázlatban ábrázoljuk, ahol R jelentése XXIV képletű csoport, illetve a reakció maximális fluoreszcenciája 510 nmeiéi észlelhető. A. Homogén direkt kötéses-fluoreszcens kimutatási módszer 2,4-dinitro-fenilcsoportra specifikus antitest meghatározására, az antitest különböző koncentrációinak hatása a reakciósebességre. Hét specifikus kötési reakcióelegyet készítünk és analizálunk. Mindegyik reakcióelegy elkészítéséhez a 4. példában ismertetett módon előállított 2,4-dinitro-fenil-fluoreszcein konjugát mikromólos dimetil-szulfoxidos oldatából 20 mikrolitert a III. táblázatban megadott mennyiségű antiszérummal, illetve elegendő mennyiségű 7-es pH-jú 0,1 mólos bisz-(hidroxi-etil)-glicin hidroklorid pufferrel kombinálunk ahhoz, hogy a kapott elegy térfoeata 2,0 ml legyen. Ezután a konjugátban levő észterkötés úgynevezett hidrolizálási bázissebességét (vagyis spontán bekövetkező hidrolizálódásának sebességét) meghatározzuk minden egyes reakcióelegyre 3 percen át az 510nm-nél észlelhető fluoreszcencia intenzitásának növekedési sebessége mérése útján, éspedig egy 470 nm-nél gerjeszthető fluorométer segítségével. Ezután minden egyes reakcióelegyhez 10 mikroliter mennyiségben olyan 0,1 mólos bisz-(hidroxi-etil)-glicin-hidroklorid puffert adunk (pH-ja 7,0), amely 0,54 egység ún. „Type I” észteráz enzimet (E. C. No. 3.1.1.1, szállítja a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri állam, amerikai egyesült államokbeli cég) tartalmaz. Az ezután 14 kialakuló összreakciósebességet éppen úgy mérjük, mint a hidrolizálási bázissebességet. A kapott eredményeket tehát a III. táblázatban adjuk meg. III. táblázat 28 Reakcióelegy sorszáma Antiszérum mennyisége (mikroliter) Hidrolizálási bázis - sebesség Összreakciósebesség 1 0 0,02 2,68 2 5 0,07 2,48 3 10 0,11 1,91 4 20 0,17 1,08 5 30 0,21 0,63 6 40 0,22 0,45 7 60 0,26 0,30 A példa ezen részében bemutattuk tehát, hogy a hidrolízises reakció sebessége (vagyis az összsebesség), fordítva arányos a specifikus kötési reakcióelegyben jelenlevő ligandum, azaz a 2,4-dinitro-fenilcsoportra specifikus antitest mennyiségével. Ugyanakkor azt is demonstráltuk, hogy a hidrolizálási bázissebesség egyenesen arányos a specifikus kötési reakcióelegyben jelenlevő antitest mennyiségével. A találmány tehát tesztkompoziciót és meghatározási módszert nyújt a 2,4-dinitro-fenilcsoportra specifikus antitestek meghatározására folyékony közegben a direkt kötéses-fluoreszcens kimutatási módszert alkalmazva. B. Homogén kompetitiv kötési-fluoreszcens kimutatási módszer 2,4-dinitro-fenil-származékok kimutatására, a 2,4-dinitro-fenil-ű-alanin különböző koncentrációinak hatása a reakciósebességre. 10 specifikus kötési reakcióelegyet állítunk elő, mindegyik össztérfogata 2,0 ml és mindegyik 0,1 mólos bisz-(hidroxi-etil)-glicin-hidroklorid puffert (7,0 pH-jú) és az alábbi IV. táblázatban megadott koncentrációkban a J. Amer. Chem. Soc., 76, 1328 (1954) irodalmi hely szerint előállítható 2,4-dinitro-fenil-ű-alanint tartalmaz. A 10 reakcióelegy közül 9-hez, éspedig a IV. táblázat 2-10. sorszámú reakcióelegyeihez 2,4-dinitro-fenilcsoportra specifikus antiszérumból olyan mennyiséget adunk, hogy a másik, vagyis az 1. reakcióelegyben végbemenő, az észteráz enzim által katalizált reakció sebessége 60%-kal csökkenjék. Alapos keverést követően minden egyes reakcióelegyhez a 4. példában ismertetett módon előállított 2,4-dinitro-fenil-fluoreszcein konjugát dimetil-szulfoxiddal készült 1 mikromólos oldatából 20 mikrolitert, majd pedig 10-10 mikroliter olyan 0,1 mólos bisz-(hidroxi-etil)-glicin-hidroklorid puffert (7,0 pH-jú), adunk, amely 0,54 egység úgynevezett „Type I” észteráz enzimet (E. C. No. 3.1.1.1, szállítja a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri állam, amerikai egyesült államokbeli cég) tartalmaz. Az ezután kialakuló reakciósebességet a példa A. részében ismertetett módon mérjük. A 2—10. reakciók reakciósebességét az 1. reakcióéhoz (az 1. reakció esetében nincs antiszérum, illetve antitest) kiszámoljuk. A kapott eredményeket az alábbi IV. táblázatban adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
