179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
21 179542 22 1. példa Nikotinamid-adenin-dinukleotid és biotin alkotta konjugát előállítása. A. Nikotinamid-6-(2-aminoetil-amino)-purin-dinukleotid. 10 ml vízben feloldunk 2 g nikotinamid-adenin-dinukleotidot (röviden: NAD), majd a kapott oldathoz 0,6 ml etilénimint adunk cseppenként, miközben pH-ját 7 alatti értéken tartjuk 1 mólos vizes perklórsavoldat adagolása útján. Miután az etilénimin adagolását befejeztük, a reakcióelegy pH-ját 4,5-re beállítjuk és a reakcióelegyet 20-25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakcióelegyhez 24 óránként 0,6 ml etilénimint adunk és a pH-t mindig 4,5-re beállítjuk. 96 óra elteltével a reakcióelegyet —10 °C hőmérsékleten 10-szeres térfogatmennyiségű acetonba öntjük, majd a kivált olajat elkülönítjük, dietiléterrel mossuk és közel 50 ml vízben feloldjuk (a vizes oldást lombikban végezzük). A kapott vizes oldat pH-ját 7,0-7,5-re beállítjuk 1 normál nátrium-hidroxid-oldattal, majd az oldathoz 1 g nátrium-hidrogén-karbonátot adunk. Az oldaton ezután 4—5 percen át nitrogéngázt buborékol tatunk át, majd 1 g nátrium-hidrogén-szulfitot adunk hozzá. A lombikot ezután légmentesen lezárjuk, majd szobahőmérsékleten 45 percen át állni hagyjuk. Az oldaton ezt követően 15 percen át oxigéngázt vezetünk át, majd pH-ját nátrium-hidroxiddal 11,3-re beállítjuk. Az oldatot ezután 75 °C-on tartjuk 1 órán át, majd szobahőmérsékletre visszahűtjük és először 0,6 g trisz-(hidroxi-metil)-amino-metánt, majd a pH 7,5-re beállításához 5 n sósavoldatot adunk hozzá. Az így kapott elegyhez ezután 1000 nemzetközi egység alkohol-dehidrogenáz enzimet és 1 ml acetaldehidet adunk, majd az így kapott reakcióelegy csökkenő optikai sűrűségét 340 nm-nél megfigyeljük és amikor már további csökkenést nem észlelünk, a pH-t 3,5-re beállítjuk. A reakcióelegyet ezt követően —10°C-on 10-szeres térfogatmennyiségű acetonba öntjük, majd a kivált olajat elkülönítjük, dietiléterrel mossuk és 10-15 ml vízben feloldjuk. A kapott vizes oldatot ezután felvisszük egy 2,5 cm x 90 cm méretű, Sephadex G—10 márkanevű gyantából (gyártja a Pharmacia AB, uppsala-i, svédországi cég) készült oszlopra, amelyet előzetesen vízzel kiegyensúlyoztunk. 12 ml térfogatú frakciót gyűjtünk. Minden egyes frakció esetében meghatározzuk az ibolyántúli színképtartományban észlelhető maximális optikai abszorpcióhoz tartozó hullámhosszt és az ennél a hullámhossznál észlelhető optikai sűrűséget. Alkohol-dehidrogenázzal végzett redukció után szintén meghatározzuk minden egyes frakció esetében a 340 nm-nél észlelhető optikai sűrűséget. Ezután összeöntjük azokat a frakciókat, amelyek optikai abszorpciójának maximuma 264 nm-nél észlelhető és amelyek esetében a 340 nm-nél észlelhető optikai sűrűség aránya a 264 nm-nél észlelhető optikai sűrűséghe^nagyobb, mint 0,05. Az összeöntött frakciók térfogatát ezután forgó vákuumbepárlóval 15—20ml-re csökkentjük, majd az így kapott koncentrátumot átbocsátjuk egy 2,5 cm x 28 cm méretű, Dowex 1-X8 márkanevű gyantából (gyártja a Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia állam, amerikai egyesült államokbeli cég) készült oszlopon, amelyet előzetesen vízzel kiegyensúlyoztunk. További mennyiségű vizet viszünk fel az oszlopra az összeöntött frakciók biztos átmosására az oszlopon, miközben 10 ml-es frakciókat gyűjtünk. Összeöntjük azokat a frakciókat, amelyek optikai abszorpciós maximuma 264 nm-nél észlelhető és amelyek esetében a 340 nm-nél észlelhető optikai sűrűség aránya a 264 nm-nél észlelhető optikai sűrűséghez nagyobb, mint 0,1. Az összeöntött frakciókat ezután átbocsátjuk egy 5 x 45 cm méretű, Dowex 50—X2 márkanevű gyantából (gyártja a fent említett Bio-Rad Laboratories cég) készült oszlopon, amelyet előzetesen vízzel kiegyensúlyoztunk. Tökéletes eluálás céljából az oszlopra további mennyiségű vizet viszünk fel, miközben 20 ml-es frakciókat gyűjtünk. Összeöntjük azokat a frakciókat, amelyek optikai abszorpciós maximuma 264 nm-nél észlelhető és amelyek esetében - a 340 nm-nél észlelhető optikai sűrűség aránya a 264 nm-nél észlelhető optikai sűrűséghez nagyobb, mint 0,18. Az összeöntött frakciókat ezután 4—5 ml térfogatra betöményítjük, majd az alábbiakban ismertetett módon elektroforézissel tisztítjuk. A betöményített anyagot Whatmann 3MM márkanevű papírra (gyártja a Reeve Angel, Clifton, New Jersey állam, amerikai egyesült államokbeli cég), éspedig az áram irányára merőlegesen nézve 1 —2 cm széles csíkra visszük fel. A papírt ezután pH 6,0-rá beállított 0,02 mólos nátrium-foszfát-oldattal nedvesítjük. Ezt követően az úgynevezett Durrum-féle függesztett papíros módszerrel [lásd: Science, 121, 829 (1955)] 4-7 órán át elektroforézist végzünk mintegy 8,5 Volt/cm-es potenciálgradienssel. A kívánt nukleotid-származék helyét fluoreszcenciásan határozzuk meg, miután a kísérleti csíkot 0,5 mólos nátrium-cianid-oldattal végzett bepermetezéssel előhívtuk [a meghatározási módszert lásd: J. Biol. Chem., 191, 447 (1951)]. A papírból kivágjuk a kívánt származékot tartalmazó területet, majd az így kapott papírdarabot háromszor 50—50 ml vízzel extraháljuk. A cím szerinti vegyületet tartalmazó extraktumokat összeöntjük, majd 3—4 ml térfogatra betöményítjük és -20 °C-on tároljuk. B. Nikotinamid-adenin-dinukleotid és biotin alkotta konjugát. 16 mg biotint szuszpendálunk 1 ml olyan vizes oldatban, amely a példa A. része szerint előállított nikotinamid- 6-( 2-aminoetil-amino)-purin-dinukleotidbóI 22 mg-ot tartalmaz. Az oldathoz ezután néhány csepp 0,1 n nátrium-hidroxid-oldatot adunk a biotin oldódásának elősegítésére. A kapott oldathoz ezután 240 mg l-ciklohexil-3-(2-morfolino-etil)-karbodiimidmeto-p-toluolszulfonátot adunk és az utóbbi reagenst 0,1 normál sósavoldat cseppenkénti adagolása útján oldatba visszük. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten 5 napon át állni hagyjuk, majd —10°C-on 10 ml acetonba öntjük. A kivált olajat ezután elkülönítjük, kétszer 5—10 ml dietiléterrel mossuk és 1-2 ml vízben oldjuk. A kapott vizes oldatot a példa A. részében ismertetett elektroforézises módszerrel tisztítjuk. Nátrium-cianiddal végzett bepermetezés 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
