179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
179542 után két fluoreszcens sáv észlelhető, az egyik a katód felé vándorol, míg a másik az anód felé. Az utóbbi sávot — amely a kívánt cím szerinti konjugátot tartalmazza — vízzel extraháljuk és a kapott vizes oldatot —20 °C-on tároljuk. 23 2. példa Specifikus kötésen alapuló homogén kimutatási módszert ismertetünk, amelynek során az avidinnek és a biotinnak az NAD és az NAD-biotin konjugátok enzimatikus ciklus-idejére kifejtett hatását hasznosítjuk. A ciklusos reakciórendszer az alábbi reakciókor alapul: a) NAD-ligandum + laktát NADH-ligandum + piruvát b) NADH-ligandum + oxidált tiazolilkék diaforáz-----------*■ NAD-ligandum + redukált tiazolilkék Nyolc specifikus kötési reakcióelegyet készítünk el, mindegyik össztérfogata 0,5 ml, mindegyik tártálmáz 7,8 pH-értékű 0,12 mólos bisz-(2-hidroxi-etil)-glicin-hidroklorid puffert, továbbá az alábbi I. táblázatban megadott koncentrációkban, illetve aktivitásban NAD-t, az 1. példában ismertetett módon előállí- 5 tott NAD-biotin konjugátot, biotint és avidint. Az utóbbi vegyidet hajlamos a biotinnal specifikus kötést létesíteni. Az avidin aktivitásának 1 egységét úgy definiáljuk, hogy az az avidinnek az a mennyisége, amely 1 mikrogram biotint megkötni képes. A reakcióit) elegyeket szobahőmérsékleten 2—3 órán át inkubáljuk, majd minden egyes reakcióelegyet olyan vizes, enzimet és szubsztrátot tartalmazó eleggyel érintkeztetjük, amely 0,1 ml 1 mólos lítium-laktát-oldatot, 0,05 ml 10 millimólos oxidált tiazolilkék-oldatot, va- 15 lamint szarvasmarha-szívből kivont laktát-dehidrogenázból 0,38 nemzetközi egységet és sertés-szívből kivont diaforázból 1,5 nemzetközi egységet tartalmazó, 7,8 pH-értékű 0,12 mólos N,N-bisz-(2-hidroxi-etil)glicin-hidroklorid pufferből 1 ml-es összreakcióelegy- 20 -térfogathoz szükséges mennyiséget tartalmaz. Ezután minden egyes reakcióelegyben meghatározzuk a redukált tiazolilkék képződésének relatív sebességét úgy, hogy az enzimet és szubsztrátot tartalmazó elegy beadagolásának időpontja utáni első órában 24 percen 25 át 750 nm-nél mérjük az egyes reakcióelegyek optikai sűrűségében bekövetkező teljes változást. Az összes műveletet kétszeresen végezzük el, és az alábbi I. táblázatban már az átlagolt eredményeket adjuk meg. 24 I. táblázat Reakció sor-' száma NAD-koncentrációja (nanomól) NAD-biotin konjugát koncentrációja (nanomól) Biotin koncentrációja (nanomól) Avidin aktivitása (egységek) Az optikai sűrűség átlagos növekedése (570 nm-nél) 1 _ _ _ 0,002 2 220 — — — 0,103 3 — 360 — — 0,079 4 — — 360 — 0,003 5 220 — — 0,11 0,103 6 — 360 — 0,11 0,025 7 — 360 360 0,11 0,069 8--0,11 0,001 Az 1., 4. és 8. reakció tulajdonképpen kontrollként szolgál. Ezek a reakciók azt bizonyítják, hogy NAD és az NAD-biotin konjugát távollétében lényegében nem következik be a ciklusos reakciórendszer kialakulása. A 2. és a 3. reakció eredményének összehasonlításából megállapítható, hogy az NAD-biotin konjugátnak a természetes NAD-éhoz képest jelentős mértékű koenzim-aktivitása van. A 3. és a 6. reakció eredményének összehasonlításából megállapítható, hogy a reakcióelegyben jelenlevő avidin inhibitálja a redukált tiazolilkék képződését akkor, ha az NAD a biotinnal konjugátban van. A 6. és 7. reakció eredményének összehasonlításából megállapítható, hogy a szabad biotin jelenléte csökkenti a redukált tiazolilkék képződése inhibitáltságának mértékét, éspedig a reakciórendszerben jelenlevő biotin koncentrációjával arányosan. Ebben a példában bemutattuk tehát, hogy az 50 NAD-biotin konjugátban levő NAD aktivitása a ciklusos reakciórendszer vonatkozásában csökken avidin jelenlétében, és ennek az aktivitáscsökkenésnek a nagysága szakad biotin jelenlétében viszont redukálódik! Ez a példa ugyanakkor demonstrálja egy, ciklu- 55 sós reakcióban részt vevő koenzim használatát jelző részként specifikus kötésen alapuló kimutatási módszernél. 60 3. példa Homogén kompetitiv megkötésen alapuló kimutatási módszert ismertetünk ebben a példában, amelyhez követési reakcióként biolumineszcens jelenséget 65 hasznosítunk, továbbá a biotin különböző koncentrá-12
