179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
3 179542 4 meghatározzák olyan reakciólépések végrehajtása útján, amelyek a nem aktív jelzőanyagot kromogén vagy fluorometriásan aktív anyaggá alakítják, és így az ismert módon mérhető. További heterogén típusú, specifikus kötésen alapuló és a fentiektől eltérő típusú jelzőanyagot alkalmazó kimutatási módszereket ismertetnek még az alábbi irodalmi helyeken: az Amerikai Egyesült Államok Kereskedelemügyi Minisztériumához (United States Department of Commerce) tartozó Nemzeti Technikai Tájékoztató Szolgálat (National Technical Information Service) „Report No. PB-224,875” jelzésű, 1973-ban megjelent kiadványában sikertelen kísérletet ismertetnek a hemin-klorid jelzőanyagként való felhasználására heterogén kimutatási rendszerben, amelyet egy kemilumineszcens reakció útján követnek. A Nature, 219,186 (1968) irodalmi helyen igen részletesen ismertetnek néhány radioimmunológiai vizsgálati módszert és rendkívül általános jellegű bekezdésben utalnak arra, hogy jelzőanyagként radioizotópok helyett lehetségesnek tűnik koenzimek és vírusok alkalmazása. Az utóbb említett cikk szerzője azonban nem ad felvilágosítást azzal kapcsolatban, hogy hogyan végzendő el egy kimutatási vizsgálat ezen utóbb említett alternatív jelzőanyagok alkalmazásával, és azt sem közli, hogy egyáltalán egy ilyen kimutatási vizsgálat sikeres volt-e. Általánosságban utalni kívánunk továbbá az Odell és Daughaday szerkesztésében megjelent, „Principles of Competitive Protein-Binding Assays” című könyvre (a könyv a J. B. Lippincott Co. phüadelphiai, amerikai egyesült államokbeli kiadó gondozásában 1972-ben jelent meg), amelyben részletesen tárgyalják a különböző ismert kimutatási módszereket, valamint különböző anyagokat és jellemzőket, amelyeket jelzésre használtak specifikus kötésen alapuló kimutatási módszereknél. Különös figyelmet érdemel továbbá a 3 817 837 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett, enzim-jelölt ligandumot alkalmazó immunológiai kimutatási módszer. Ez a módszer ugyanis homogén típusú, azaz nincs szükség esetében megosztott (azaz oldhatatlan részre és folyékony részre osztott) specifikus kötésű reakciórendszer és ezáltal szeparálási művelet alkalmazására, minthogy az enzim-jelzett ligandum úgy van „kialakítva”, hogy a ligandum specifikus kötőpartnerével végbemenő reakció során az enzimaktivitás inhibitált. így a kötött jelzett anyagnak a szabad formához viszonyított aránya meghatározható az enzimaktivitásban bekövetkező változások követése útján. E módszer súlyos hátránya azonban, hogy rendkívül nehéz jól jellemezhető enzim-jelölt konjugátok előállítása és olyan enzimek megtalálása, amelyek ebben a rendszerben hasznosíthatók. Bár specifikus kötésen alapuló kimutatási módszerekre számos új típust javasoltak, továbbra is a radioimmunológiai módszerek és a különböző enzim-jelölt immunológiai módszerek maradtak elterjedve. Mindkét alkalmazott módszernek azonban kézenfekvő hátrányai vannak, éspedig a radioimmunológiai módszeré a radioaktív anyagok veszélyes és rendkí2 vüli óvatosságot igénylő alkalmazása, míg az enzim-jelölt immunológiai módszeré az enzim-jelölt konjugátok előállításának nehézsége. Azt találtuk, hogy antigének és haptének kimutatására alkalmas rendkívül egyszerű, gyors és érzékeny, specifikus kötésen alapuló módszerhez, illetve kompozícióhoz jutunk, ha jelzőanyagként egy olyan vegyületet használunk, amely egy előre meghatározott követő reakciórendszer (vagyis a specifikus kötési reakciót követő reakciórendszer) egyik alkotórésze vagyis ebben a reakciórendszerben részt vesz. Ezt az anyagot a továbbiakban reaktánsnak fogjuk nevezni. Ez az anyag felhasználható egy új homogén kimutatási technikában vagy bármely hagyományos heterogén kimutatási technikában. Követő reakciórendszerként előnyösen enzimkatalizált reakciórendszereket használunk. Rendszerint olyan követő reakciórendszert választunk, amely nagymértékben érzékeny a későbbiekben még ismertetendő konjugátba vitt reaktánsra. Ilyen vonatkozásban rendkívül előnyösen használhatunk lumineszcens vagy fluoreszkáló reakció rendszereket. Különösen előnyösek az úgynevezett ciklikus reakciórendszerek, ezek közül is pedig különösen azok, amelyekben a reaktáns a ciklusban részt vevő anyag Az előnyös ciklikus reakciórendszerek közül különösen előnyösek az enzimkatalizáltak. A konjugátban a reaktáns rendszerint egy enzimatikus reaktáns, például egy enzimszubsztrát, vagy — ami különösen előnyös - egy koenzim, és molekulasúlya előnyösen 9000-nél kisebb. A találmány világos megértéséhez az alábbi kifejezések meghatározását látjuk szükségesnek: „ligandum” az az anyag vagy anyagok csoportja, amelynek jelenlétét vagy mennyiségét kívánjuk egy folyékony közegben mérni, „a ligandum specifikus kötőpartnere” az az anyag, illetve anyagok csoportja, amely a ligandummal szemben specifikus kötés-affinitást mutat, és ugyanakkor más anyagokat nem enged a ligandummal kötésbe lépni, és a „ligandum specifikus kötési analógja” az az anyag, illetve anyagok csoportja, amely lényegében a ligandummal azonos módon vselkedik a ligandum specifikus kötőpartnere kötési affinitása vonatkozásában. Az új homogén kimutatási technika részben azon a tényen alapul, hogy olyan ligandum és e ligandum specifikus kötőpartnere közötti reakció, amelyek közül az egyikhez a reaktáns hozzá van kapcsolva kémiailag, megváltoztatja a reaktáns aktivitását egy előre meghatározott reakcióban, amely reakció így a specifikus kötési reakció követésére szolgál. Ezen alapvető jelenségre tekintettel különböző kísérleti kompozíciókat és eszközöket alkalmazó különböző manipulativ sémák alkalmazhatók a találmány szerinti kimutatási módszer megvalósítására. Az előnyös alapvető manipulativ sémák közé tartozik az úgynevezett direkt kötési módszer és a kompetitiv kötési módszer. Az úgynevezett direkt kötési módszer esetében a kimutatandó ligandumot feltételezhetően tartalmazó folyadékmintát olyan konjugáttal érintkeztetjük, amely a ligandum specifikus kötőpartneréhez kapcsolt reaktánsból áll, és ezután a reaktáns aktivi5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 65
