179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
5 179542 6 tásában bekövetkező bárminemű változást mérjük. A kompetitiv kötési módszer esetében a kimutatandó ligandumot feltételezhetően tartalmazó folyadékmintát a ligandum egyik specifikus kötőpartnerével és egy olyan konjugáttal érintkeztetjük, amelyet a reaktánsnak a ligandumhoz és/vagy a ligandum specifikus kötési analógjához való kémiai kötése útján kaptunk, ezt követően pedig a reaktáns aktivitásban bekövetkező bárminemű változást mérjük. Mindkét módszer esetében a reaktáns aktivitását úgy határozzuk meg, hogy a folyadékmintát legalább egy olyan reagenssel érintkeztetjük, amely a reaktánssal az előre meghatározott követő reakciót végrehajtja. A folyadékmintában a ligandum kvalitatív meghatározása abban áll, hogy az így végbemenő követési reakció egyik jellemzőjét, rendszerint sebességét összehasonlítjuk egy olyan folyadékmintában végbemenő követési reakció megfelelő jellemzőjével, amely nem tartalmaz ligandumot, és ha a két jellemző között bármiféle különbséget észlelünk, ez a reaktáns aktivitásának változására és így a ligandum jelenlétére utal. A folyadékmintában a ligandum kvantitatív meghatározása abban áll, hogy a követési reakció egyik jellemzőjét összehasonlítjuk olyan folyékony közegben végbemenő követési reakció jellemzőjével, amely ismert mennyiségű ligandumot tartalmaz. Általában ha a homogén kimutatási módszer szerint járunk el, akkor a specifikus kötési reakció komponenseit, azaz a feltételezhetően ligandumot tartalmazó folyadékmintát, a konjugátot és/vagy a ligandum specifikus kötőpartnerét bármilyen mennyiségben, módon és sorrendben kombinálhatjuk egymással, feltéve, hogy a konjugátban kötött reaktáns aktivitása mérhető mértékben változik meg abban az esetben, ha a vizsgált folyadékminta ligandumot tartalmaz olyan mennyiségben, amely szignifikáns a kimutatás szempontjából. Előnyös, ha a specifikus kötési reakcióban részt vevő összes komponens oldható a folyadékmintában. Ha direkt kötési módszer szerint homogén kimutatási technikával járunk el, akkor a specifikus kötési reakció komponensei a feltételezhetően ligandumot tartalmazó folyadékminta és egy olyan konjugát meghatározott mennyisége, amely a ligandum specifikus kötőpartneréhez kapcsolt reaktánsból áll. A konjugátba vitt reaktáns aktivitása a folyadékmintával való érintkezés során fordítva arányos a folyadékmintában levő. ligandum és a konjugátban levő specifikus kötőpartnere közötti kötés mértékével. így amikor a folyadékmintában a ligandum mennyisége nő, akkor a konjugátba vitt reaktáns aktivitása csökken. Ha kompetitiv kötési módszer szerint homogén kimutatási technikával járunk el, akkor a specifikus kötési reakció komponensei a feltételezhetően ligandumot tartalmazó folyadékminta, egy olyan konjugát meghatározott mennyisége, amely a ligandumhoz vagy a ligandum specifikus kötési analógjához kapcsolt reaktánsból áÜ, valamint a ligandum specifikus kötőpartnerének egy meghatározott mennyisége. A ligandum specifikus kötőpartnerét lényegében egyidejűleg érintkeztetjük a konjugáttal és a folyadékmintával. Tekintettel arra, hogy a folyadékmintában levő bár ely ligandum verseng a konjugátban levő ligandefttímal vagy a ligandum konjugátban levő specifikus kötési analógjával a specifikus kötőpartnerrel való kötési reakcióba lépésért, a konjugátban kötött reaktáns'-akfívitása a folyadékmintával való érintkezés során egyenesen arányos a folyadékmintában levő ligandum és specifikus kötőpartnere közötti kötési reakció mértékével. így ha a folyadékmintában a ligandum mennyisége nő. akkor a konjugátba vitt reaktáns aktivitása is nő. A kompetitiv kötési módszeren alapuló homogén kimutatási technika egy változat” az úgynevezett helyettesítéses kötési módszeren alapuló homogén kimutatási technika, ahol a konjugátot először a ligandum specifikus kötőpartnerével érintkeztetjük és csak ezután a folyadékmintával. Ekkor következik be a verseny a specifikus kötőpartnerért. Ennek a módszernek az esetében a specifikus kötői artnerrel érintkeztetett konjugát mennyisége rendszerint célszerűen az a mennyiség, amely a ligandumot vagy a ligandum kötési analógját fölöslegben tartalmazza ahhoz a mennyiséghez képest, amely képes kötési reakcióba lépni a specifikus kötőpartner azon mennyiségével, amely jelen van azon idő alatt, amikor a konjugát és specifikus kötőpartner érintkezésben vannak egymással a feltételezhetően ligandumot tartalmazó folyadékmintával való érintkezést megelőzően. Ezt az érintkeztetési sorrendet az alábbi két egyszerű út valamelyikével biztosíthatjuk: Az egyik módszer szerint a konjugátot a specifikus kötőpartnerrel folyékony közegben érintkeztetjük a feltételezhetően ligandumot tartalmazó folyadékmintával való érintkeztetést megelőzően. A másik módszer szerint a feltételezhetően ligandumot tartalmazó folyadékmintát olyan komplexszel érintkeztetjük, amely a konjugátbó! és a specifikus kötőpartnerből áll, amikor is a konjugátban levő, specifikus kötésre képes anyag és a specifikus kötőpartner reverzibilisen vannak egymáshoz kötve. A második módszer értelmében komplexben levő specifikus kötőpartnerhez kapcsolt konjugát mennyisége rendszerint fölöslegben van ahhoz a mennyiséghez képest, amelyet a vizsgált folyadékmintában levő ligandumok teljes mennyisége képes kiszorítani vagy helyettesíteni azon idő alatt, amikor a specifikus kötőpartner vagy a komplex és a folyadékminta egymással érintkezésben vannak a konjugátban kötött reaktáns aktivitásában bekövetkező bárminemű változás kiértékelésének befejezését megelőzően. A kompetitiv kötési módszeren alapuló homogén kimutatási technika egy további változata az úgynevezett fokozatos telítésen alapuló homogén kimutatási technika, amelynek esetében a specifikus kötési reakcióban részt vevő komponensek azonosak a helyettesítéses kötési módszeren alapuló homogén kimutatási technika esetében alkalmazottakkal, azonban a komponensek adagolásának sorrendje vagy egymással való kombinálásuk sorrendje, valamint alkalmazott relatív mennyiségeik eltérőek. Ha a fokozatos telítéses módszer szerint járunk el, akkor a ligandum specifikus kötőpartnerét a feltételezhetően ligandumot tartalmazó folyadékmintával érintkeztetjük egy időn át azt megelőzően, hogy a folyadékminta a 3 S 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
