179497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az inzulin-kiválasztást befolyásoló biológiailag hatásos anyag előállítására Bordetella-pertussis felhasználásával
7 179497 8 ióval összhangban kapjuk az aktiv faktort. (A 3. ábra övidítései az 1. ábráéval azonosak.) Mivel az így kapott frakció discelektroforézissel kinutatható igen kevés szennyezést még mindig tartalnaz, ezt a proteinfrakciót összegyűjtjük, kondenzáljuk, 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,01 M foszfátpufferral (pH = 7) dializáljuk, és a dializált mintát 2,8 x 60 cm-es „Biogel P—100” (A BIO.RAD Co. kereskedelmi terméke) oszlopon — amelyet az azonos pufferral egyensúlyba hoztunk — gélszűrésnek ve^ük alá. így a 4. ábra szerinti proteinfrakcióval összhangban kapjuk a tiszta aktív faktort, amelynek maximuma 80 000 molekulasúlynál van. Az ily módon előállított új protein — mint már 5 említettük — a szigeteket-aktiváló-protein (Islets-Aktivierungs-Protein, IAP). Az izolálási és tisztítási eljárás során kapott aktivitásokat, tisztasági fokokat és más adatokat a 2. táblázat szemlélteti. Az anyag tulajdonságait már ko- 10 rábban ismertettük. 2. táblázat A végzett művelet Az oldat mennyisége (ml) Protein konc. (Mg/ml) Összes protein (mg) Faji. aktivitás (egység/Mg) Aktivitás hozam (%) Tisztítás A táptalaj felülúszó része 10 000 2 000 22 000 0,318 100 1 Hidroxiapatit oszlopkrom. 125 159 19,9 193,0 55 607 „CM-Sepharose”oszlopkrom. 45 251 11,3 321,0 52 1 009 „Con A-Sepharose” oszlopkrom. 50 176 8,8 380,0 48 1 195 „Biogel P-100” oszlopkrom. 40 168 6,7 429,0 41 1 349 Megjegyzés: A proteinkoncentrációt Lowry és társai eljárásával mértük [Lowry O. H., N. J. Rosenbrough, A. L. Farr und R. J. Randall: J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)], standardként marhaszérumalbumint használtunk. Az említett utolsó műveletben kapott, szigeteket-aktiváló-proteinnek nevezett anyagot políakrilamidgéllei végzett discelektroforézissel (poliakrilamidkoncentráció 7,5%, 1 n káliumhidroxíd-jégecet puffer, pH = 4,3) határoztuk meg. A kísérlet kivitelezéséhez J.V. Maizei Jr. eljárását [Biochem. Biophys. Rés. Comm., 13,483 (1963) használtuk. A gélhez adott minta mennyisége 30 Mg (mint protein), 2 órán át 4 mA erősségű áramot alkalmaztunk, a gél festését Amidoschwarz 10B-vel, mosását 7%-os ecetsavoldattal végeztük. A kapott eredmények az 5. ábrán láthatók, ahol grafikusan ábrázoljuk a gélsávot, és bemutatjuk a denzitométer alkalmazásával kapott megfelelő elektroferogramot. Bebizonyosodott, hogy a végső műveletben kapott vegyület egyetlen, szennyezésektől tökételesen mentes anyag, és hogy a 2. példában leírt inzulinkiválasztást elősegítő hatás az izolált anyaggal jó összhangban van. Az aktiváló protein szubstruktúrájának meghatározására az anyagot alávetjük a közelebbről ismertetendő nátriumdodecilszulfát-poliakrilamidgél-elekt-40 roforézisnek, amit Shapilo és társai eljárásával [A. L. Shapilo et al.: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 28, 815 (1967)] végzünk. 50 üg/cső (bemérés mint protein) szigeteket-akti- 45 váló-protein mintát adunk 1% nátriumdodecilszulfátot, 1% 2-merkaptoetanolt és 4 M karbamidot tartalmazó keverékhez, a keveréket 37 °C-on 2 órán át inkubáljuk, majd 1% nátriumdodecilszulfátot tartalmazó 10%-os poliakrilamidgélre felvisszük, 4 órán át 50 8 mA/gél áramot vezetünk be, és a gélt Coomassie-Blau színezékkel megfestjük, és 7,5%-os ecetsavval mossuk. Az így kapott eredmények a 6. ábrán láthatók, ahol grafikusan ábrázoljuk a gélsávot, és bemutatjuk a denzitométer segítségével kapott megfe- 55 lelő elektroferogramot (SDS = nátriumdodecilszulfát). 2. Liofilizált és konzervált patogén Bordetella pertussis mikroorganizmusokat [NIH 114(3779B) törzs] (Department of Bacteriology, Kitasato University 60 School of Pharmaceutical Sciences) az 1. példa 1. pontja szerint rázott tenyészetként tenyésztünk, és a tenyészetet szétválasztjuk, ekkor a folyékony tenyészetből 10 liter felülúszót kapunk. Az így kapott felülúszó részt két részre osztjuk, az 65 egyik pH-értékét 1 n sósavval 6,0-ra beállítjuk, és 4
