179497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az inzulin-kiválasztást befolyásoló biológiailag hatásos anyag előállítására Bordetella-pertussis felhasználásával
9 179497 10 200 ml/óra sebességgel 2,5 x 4 cm-es hidroxiapatit oszlopra vezetjük. Az oszlopot vízzel mossuk, majd az adszorbeált anyagot 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó, 7 pH-értékű 0,1 M foszfátpufferral eluáljuk. Az így kapott eluátumot 8000 molekulasúlyra maximális áteresztőképességű dializáló membránba („Thomas Cat. Nr. 3787-F25” kereskedelmi termék) tesszük, és háromszor (összesen 18 órán át) dializáljuk desztillált vízzel, így megkapjuk az aktív anyagot. Ezt liofilizáljuk, ekkor barnásfehér színű finom proteinport kapunk („A” minta), ami az inzulinkiválasztást elősegítő faktorral ekvivalens. A folyékony tenyészet felülúszójának másik részéhez (5 liter) 90%-os telítettségi fokig (a pH-értékét gyenge ammóniumhidroxiddal 6,5-re beállítjuk) ammóniumszulfátot adunk, ekkor csaknem valamennyi proteinjellegű anyag kicsapódik. A csapadékot vízzel tökéletesen kimossuk, majd 0,1 M trisz-0. 5 M nátriumklorid pufferral (pH = 9) extraháljuk. Az így kapott extraktum-oldatot először 1 n sósavval semlegesítjük, majd a fenti dializáló membránt használva, desztillált vízzel szemben háromszor (összesen 18 órán át) dializáljuk. így 11,2 mg liofilizált port („B” minta) kapunk. 3. Liofilizált és konzervált patogén Bordetella pertussis mikroorganizmusokkal (I fázisú Maeno törzs) (Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) megismételjük az 1. példa 1. pont szerinti eljárást. így liofilizált por alakjában 23,6, illetve 10,8 mg aktív anyagot kapunk („C” és „D” minta). A minták aktivitása és akut toxicitása Valamennyi minta aktivitását a 2. példában ismertetendő eljárással határozzuk meg. A kapott eredményeket a 3. táblázat szemlélteti. 3. táblázat Minta Fajlagos aktivitás (egység/jug) A 57,1 B 93,0 C 127,2 D 81,0 A minták akut toxicitását (LD5 0)a4. táblázatban foglaljuk össze. 4. táblázat Minta LDS o (Mg/kg testsúly) Intravénás injekcióban egérnek beadva A 1620 B 2510 C 2890 D 3020 Az eredmények azt mutatják, hogy az aktív anyag por alakjában előállított mintája mint gyógyszer vagy mint megelőző szer diabetes kezelésére éppúgy alkalmas, mint a szigeteket-aktiváló-protein, emellett tekintetbe kell venni, hogy effektiv dózisa 1-100/ag/kg testsúly. 4. Patogén Bordetella pertussis mikroorganizmusokat (I fázisú Tohama törzs) (Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Science) az 1. példa 1. pontja szerint tenyésztünk, és a táptalaj felülúszó részét — amit az organizmusoknak a közegből történő elkülönítésével kapunk — használjuk kiindulási anyagként. Szárazjéggel hűtött acetont rázás és jeges hűtés közben 100 liter felülúszó részbe csepegtetünk úgy, hogy a végső koncentráció 60£ legyen. Ekkor a képződött csapadékot folyamatos centrifugálszeparátorral (5000 ford./perc, 4 °C) szeparáljuk. Az így kapott csapadékot szárítjuk, és ezt a terméket 500 ml 0,01 M foszfátpufferban (pH - 6,0) feloldjuk, majd az oldatot 5x4 cm-es hidroxiapatit oszlopra tápláljuk. Az aktivitást azokban a frakciókban kapjuk, amelyeket 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferral (pH = 7,0) eluáltunk. Az eluált anyagot összegyűjtjük, koncentráljuk, és 0,01 M foszfátpufferral (pH = 6,0) szemben dializáljuk, majd 2,5 x 25 cm-es „CM—Sepharose CL-6B” oszlopra vezetjük, amit előzetesen ugyanezzel a pufferral egyensúlyba hoztunk. Az aktív anyagot 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferral eluáljuk. Az ily módon eluált aktív anyagot összegyűjtjük, koncentráljuk, és 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferral szemben dializáljuk. Ezután az aktív anyagot 2 x 105 cm-es „Biogel P-150” oszlopra vezetjük, amit előzetesen 0,5 M nátriumkloridot és 4 M karbamidot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferral egyensúlyba hoztunk. Az így kapott aktív anyag egy protein, amelynek kb. 80 000 molekulasúly-tartományba esik a maximuma. 38 mg anyagot kapunk liofilizált por alakjában. Ennek az anyagnak a kémiai összetétele a következő: protein: 95 súly% és ennél több, szénhidrát: 1-2 súly%, lipidek nem határozhatók meg. A fajlagos aktivitás 930 egység//ig. 5. Liofilizált és konzervált patogén Bordetella pertussis mikroorganizmusokat (I fázisú Tohama törzs) (Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint mint rázott tenyészetet tenyésztünk. A baktériumsejteknek a folyékony tenyészlétől történő elválasztásával 100 liter felülúszót kapunk. Az így kapott felülúszót rázás közben, alacsony hőmérsékleten 50%-os vizes cinkklorid-oldattal elegyítve a pH-értékét 6,0-ra beállítjuk (végső koncentráció: 1%). Az így kapott csapadékot 10%-os dinátiiumhidrogénfoszfát-oldatban feloldjuk, és dializáló membránba tesszük, vízzel szemben dializáljuk, majd 0,01 M foszfátpufferral egyensúlyba hozzuk. Az ily módon kapott oldatot 10x5 cm-es hidroxiapatit oszlopra tápláljuk, és először 0,1 M foszfátpufferral (pH = 7,0) mossuk, majd 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferral eluáljuk. Az eluátumot koncentráljuk, 2,5 x 100 cm-es „Sephacryl S-200” (a Pharmacia Fine Chemicals kereskedelmi 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 . 65 5
