179464. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-40 104 jelű antibiotikum előállítására
7 179464 8 nálhatunk. A nagyméretű fermentációkkor szénforrásként előnyösen például glükózt, tápióka dextrint, keményítőt és kukoricaolajat használunk, bár adhatunk a táptalajhoz glicerint, maltózt, fruktózt és hasonlókat is. Használhatjuk szénforrásként az olajsavat, laurilsavat és a lecitint is. Nitrogénforrásként előnyösen szójabab lisztet, szójabab őrleményt, vagy szárított kulyaeledel és élesztő keverékét használjuk. Használhatunk nitrogénforrásként élesztőt, gyapotmaglisztet, mogyorólisztet, húspeptont és szárított kutyaeledelt is. Bár a növekedéshez és az antibiotikum termeléséhez a szervetlen sók jelenléte nem lényeges, adhatunk a táptalajhoz nátrium-, magnézium-, kalcium-, ammonium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrát- és más ionokra disszociáló, oldódó sókat. így például, ha a táptalajt 0,05% magnéziumszulfáttal (7 H20) és 0,2% kalciumkarbonáttal egészítjük ki, az antibiotikumtermelés nő. Hozzáadhatjuk a táptalajhoz a növekedés és a mikroorganizmus fejlődését elősegítő nyomelemeket. Ezek a nyomelemek a mikroorganizmus növekedéséhez elegendő mennyiségben általában mint szenynyező anyagok jelen vannak a táptalaj többi összetevőjében. Abban az esetben is, ha a nagyméretű fermentáció során a táptalaj habzása nehézséget okoz, kismennyiségű (például literenként 0,2 ml) habzásgátlószert, például polipropilén-glikolt adunk a táptalajhoz. Nagymennyiségű A—40 104 antibiotikumok előállítására tankfermentorban süllyesztett, levegőztetett fermentációt végzünk. Kismennyiségű A—40 104 antibiotikumokat rázott lombikokban is előállíthatunk. Mivel az antibiotikum termelésben lagfázis figyelhető meg, ha a nagytérfogatú tankfermentort kismennyiségű tenyészette] oltjuk, előnyösen úgy járunk el, hogy nagymennyiségű és aktívan növekvő sejtet tartalmazó vegetatív inokulumot használunk az oltáskor. A vegetatív inokulum előállítására kismennyiségű táptalajt a mikroorganizmus micéliumdarabkáival oltunk, amelyet a mikroorganizmus friss és aktívan növekvő tenyészetéből nyerünk. Ezután a vegetatív inokulummal oltjuk a nagytérfogatú tankfermentorban levő táptalajt. A vegetatív inokulum elkészítéséhez használt táptalaj a főfermentációs táptalajjal azonos vagy attól különböző lehet. Az A—40 104 antibiotikumokat termelő Clitopilus pseudo-pinsitus mikroorganizmus 20 °C és 33 °C közötti hőmérsékleten növekszik. Az A—40 104 antibiotikumok termelését előnyösen 30 °C hőmérsékleten végezzük. Ahogy a levegőztetett és süllyesztett tenyésztésekkor szokásos, a kevert táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A mikroorganizmus megfelelő növekedéséhez megfelelő levegőztetés és kevertetés szükséges, olyan mértékben, hogy az oldott oxigén koncentrációja a lehetségesnek közel 80%-át érje el. Ha az oldott oxigén mennyisége alacsonyabb, úgy az A—40 104 A komponens és C komponens termelése csökken, a gyenge levegőztetés hatása különösen az A komponens termelésére nézve kedvezőtlen. A fermentáció során először az A—40—104 C komponens jelenik meg, majd később az A-40 104 A. Az A—40 104 A komponens termelése szempontjából ezért körülbelül 12 napos fermentációs idő az előnyös. Ha a táptalajhoz kukoricaolajat adunk, úgy a C komponens átalakulása A komponenssé fokozódik. Az A-40 104 A komponens termelése szempontjából előnyös fermentációs körülmények között a termelt összantibiotikum 70% és 90% közötti mennyisége az A komponens. A süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülmények között termelt és az előzőekben ismertetett A—40—í04 antibiotikumok elkülönítése a táptalajtól a fermentációs iparban ismert módszerekkel történik. A fermentáció során termelt antibiotikum nagy része a fermentlében található. Az A—40 104 antibiotikumok izolálására ezért kombinált módszereket, köztük szűrést, a szűrt fermentlé extrakcióját és adszorpciós kromatográfiát használunk. Különösen előnyös az az eljárás, amelynek során a szűrt tenyészlevet először toluollal, majd kloroformmal extraháljuk. Az A-40 104 C komponenst a toluolos extraktumból, az A—40 104 A komponenst pedig a kloroformos extraktumból izoláljuk. Az A—40 104 B minor komponenst az A—40 104 A komponens tisztítása közben adszorpciós kromatográfiával különítjük el. A találmány szerinti eljárás másik előnyös kivitelezési változata szerint a táptalaj-komponenseket és a micéliumot magába foglaló szilárd halmazállapotú fermentációs maradékot használjuk az A—40 104 antibiotikumok kinyerésére extrakció és elkülönítés nélkül, előnyösen a víz eltávolítását követően. így például úgy járunk el, hogy az A-40 104 antibiotikumok fermentációs előállítása után fagyasztva szárítjuk a tenyészlevet és így közvetlenül keverjük a takarmány-premixbe. A találmány szerinti eljárás egy következő előnyös kivitelezési változata szerint az A-40 104 antibiotikumok fermentációs előállítása után elkülönítjük a micéliumot, majd fagyasztva szárítjuk a szűrt tenyészlevet, és az így kapott A-40 104 antibiotikum-komplexet tartalmazó terméket közvetlenül a takarmány-premixhez keverjük. Az A—40 104 antibiotikumok termelése, izolálása és az egyes antibiotikum-komponensek elkülönítése során a termelést és az elkülönítési folyamatot előnyösen kromatográfiás méréssel követjük. A mérést például szilikagél vékonyrétegkromatográfiával, oldószerelegyként kloroform és metanol 9 :1 arányú elegyét és bioindikátorként Micrococcus luteus mikroorganizmust használva végezzük. A következőkben az A-40 104 antibiotikumok aktivitását ismertetjük. Az A—40 104 antibiotikum-komplex és az A—40 104 A és B komponensek bizonyos patogén mikroorganizmusok, különösen a Gram-pozitív festődésű baktériumok növekedését gátolja. Különösen előnyös baktériumellenes vegyület az A-40 104 A. Az A-40 104 A komponens legkisebb növekedésgátló koncentrációit kiválasztott baktériumokkal szemben meghatároztuk, a sztenderd agarhígításos vizsgálattal kapott eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg. Jelentős tulajdonsága az A—40 104 antibiotikumoknak, hogy más antibiotikumokra rezisztens mikroorganizmusok növekedését gátolják. A 4. táblázatban összefoglaljuk a sztenderd papírkorong-lemez-méréssel az A-40 104 A és B komponensekkel kiválasztott mikroorganizmusokkal szemben kapott eredmé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
