179463. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dexozi-narazin antibiotikum-komplex előállítására
9 179463 10 nosavak, például glutaminsav és hasonlóak is. Szervetlen sókat is adagolunk a táptalajhoz, ezek a sók nátrium-, magnézium-, kalcium-, ammonium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrát- és más ionokra disszociálnak. A mikroorganizmus növekedéséhez és kifejlődéséhez szükséges eszenciális nyomelemeket is hozzáadjuk a táptalajhoz. Ezek a nyomelemek azonban általában szennyezésként már jelen vannak a táptalaj többi összetevőjében, mégpedig olyan mennyiségben, amely a mikroorganizmus növekedési igényeit kielégíti. Adott esetben kevés, literenként 0,2 ml habzásgátló anyagot, például polipropilén-glikolt adunk a nagytérfogatú fermentációs táptalajához, ha habzás nehészégeket okoz. Bár ez nem lényeges, az antibiotikum-termelést kevés olaj, például szójabab-olaj adagolással fokozhatjuk. Nagymennyiségű dezoxi-narazin antibiotikumok előállításakor süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülményeket biztosító fermentorokat használunk. Kismennyiségű hatóanyagot rázott tenyészetekkel állíthatunk elő. Az antibiotikum termelésében mutatkozó lag-szakasz miatt, amely gyakran jelentkezik, ha a nagytérfogatú fermentorokat a mikroorganizmus spóráival oltjuk, előnyösen vegetatív inokulumot használunk. A vegetatív inokul um előállítására kistérfogatú táptalajt a mikroorganizmus spóráival vagy micéliumaival oltunk, majd tenyésztés után friss, aktívan növekvő tenyészethez jutunk. Ezután a fermentorban sterilezett táptalajt ezzel a vegetatív inokulummal oltjuk be. Az inokulum előállításához használt táptalaj a főfermentációs táptalajjal azonos lehet, de használhatunk más összetételű táptalajt is. A dezoxi-narazint termelő mikroorganizmus 20 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten növekszik. A dezoxi-narazin termelésének optimuma 27 °C és 30 °C között van. Ahogy az a levegőztetett és süllyesztett tenyésztésekkor szokásos, a tenyészleven steril levegőt buborékoltatunk át. A mikroorganizmus gyors növekedése érdekében a táptalajon percenként átáramoltatott levegő térfogata nagyobb, mint 0,1 térfogat levegő/térfogat táptalaj. Nagymennyiségű antibiotikum előállítására percenként több mint 0,25 térfogat/táptalaj térfogat levegőt vezetünk át a táptalajon. Ha az oldott oxigén koncentrációja magas, az antibiotikum-termelés nem csökken. A fermentáció közben az antibiotikum termelését úgy vizsgáljuk, hogy a táptalaj mintáit vagy a micélium extraktumait az antibiotikumokra érzékeny mikroorganizmusokkal szemben mérjük. Tesztorganizmusként a Bacillus subtilis ATCC 6633 mikroorganizmust használjuk. A biológiai értékmérést ismert módon papírkorongokkal és agar-lemezekkel végezzük. További kényelmes mérési módszer a turbidometriás mérés, amit félautomata készüléken (AutoturbR mikrobiológiai mérőrendszer, Elanco) végzünk, amit Kuzel és Kavanaugh ismertet (J. Pharmaceut. Sei., 60, 764-767, 1971). A dezoxi-narazin antibiotikumok mérésekor a következő kísérleti paramétereket használjuk: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B—314 mikroorganizmust használunk folyékony halmazállapotú táptalajban (nutrient), amelynek pH-ját 7-re állítjuk be. A mikroorganizmust 4 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A vizsgálandó mintákat és a sztenderd anyagot metanol és víz 1 :1 arányú elegy ében oldjuk. A sztenderd vegyületet, az A—28 086- -A komponenst 1, 2, 3,4 és 5 pg/ml koncentrációban adagoljuk az AutóturbR mérőedényeibe. A még nem beoltott táptalaj eredeti pH-ja a használt táptalaj összetételétől függ. Általában 6,0 és 7,0 közötti értékre állítjuk be a táptalaj pH-ját. A fermentáció végén a tenyészet pH-ja általában valamivel magasabb, általában 6,5 és 8,0 közé esik. Az antibiotikum aktivitása általában a fermentáció második napján már mérhető. A maximális antibiotikum aktivitás általában a 4. és 7. nap között mérhető. A süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között kivitelezett tenyésztést követően az előzőleg megadott dezoxi-narazin antibiotikumokat a fermentációs szakemberek körében ismert módszerekkel különítjük el. A fermentáció során termelt antibiotikumok a micéliumon és a szűrt lében is megtalálhatók. Ily módon a dezoxi-narazin antibiotikumok teljes elkülönítése érdekében kombinált módszereket alkalmazunk, köztük szűrést, extrakciót és adszorpciós kromatográfiát. A dezoxi-narazin antibiotikumoknak a teljes vagy szűrt fermentléből való elkülönítésére előnyösen etilacetátot használunk, bár kielégítő eredményt kapunk más oldószerek használatakor is. A dezoxi-narazin antibiotikumok különösen előnyös elkülönítési eljárása értelmében úgy járunk el, hogy a fermentlé pH-ját alacsony, 3,0 körüli értékre állítjuk be. Ezen a pH-n a dezoxi-narazin antibiotikumokat a micéliumtömegről szűrést követően elkülöníthetjük. Ezt a módszert Boeck és Berg a 4 009 262 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertették az A-28 086 A, B és D komponensek, továbbá a salinomicin elkülönítése kapcsán. Ezen módszer egy másik előnyös kivitelezési módja szerint bikarbonátot, például nátriumbikarbonátot adunk a fermentléhez, literenként 1 grammot. Eszerint a módszer szerint a dezoxi-narazin antibiotikumokat könnyen elkülöníthetjük a micéliumról, sóik alakjában. Az antibiotikumokat a micéliumról metanollal extraháljuk, de használhatunk más rövidszénláncú alkoholokat és ketonokat is. Dezoxi-narazin antibiotikumok előnyös elkülönítési változatát jelenti az azeotrop desztilláció. Eszerint a módszer szerint a vizes fermentléhez vízzel azeotropot alkotó szerves oldószert adunk. Ezt az oldószer-fermentlé elegyet legalább a fele mennyiségű víz eltávolítására azeotrop desztillálónak vetjük alá, ami után olyan víz-oldószer elegyet kapunk, amelyben a dezoxi-narazin antibiotikumok a szerves oldószer részben vannak oldva. Oldhatatlan melléktermékek elkülönítésére például szűrést vagy centrifugálást használunk. A dezoxi-narazin antibiotikumokat a szerves oldószerből ismert módszerekkel, például az oldószer desztillációjával, nem oldószer adagolásával végzett kicsapással vagy extrakcióval különítjük el. Vízzel azeotropot alkotó szerves oldószerként például butilalkoholt, amilalkoholt, hexilalkoholt, benzilalkoholt, butilacetátot, amilacetátot, 1,2-diklóretánt, 3-pentanont, 2-hexanont, benzolt, ciklohexanont, toluolt, xilolokat és hasonlókat használunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
