179463. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dexozi-narazin antibiotikum-komplex előállítására
7 179463 8 például szűréssel, az oldószert desztillálóval való eltávolításával különítjük el. Hasonló módszerrel állítjuk elő a szerves aminokkal képzett sókat. Például úgy járunk el, hogy a megfelelő oldószerben, például acetonban oldott antibiotikumhoz gáz alakú vagy folyékony halmazállapotú amint adunk, majd például desztillációval eltávolítjuk az oldószert és a nem reagált amint. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint a dezoxi-narazin antibiotikumok előnyös sóit úgy állítjuk elő^hogy az elkülönítési eljárás során a tenyészlé pH-ját egy előnyös bázissal megfelelő értékre állítjuk, vagy az extraháláshoz használt oldószerhez,előnyös kationra disszociáló sót adunk. Az állatorvosi gyógyszerészeiben ismeretes, hogy az állat antibiotikummal való kezelésekor az antibiotikum alakja nem lényeges. A legtöbb esetben az állati szervezeten belül az adagolt alak megváltozik. Ezért az adagolható só alakja a kezelés módszerét nem befolyásolja. Az előállítandó sót úgy választjuk meg, hogy gazdasági, kényelmi és toxicitási szempontokat veszünk figyelembe. A találmány értelmében az új antibiotikumok előállítására egy dezoxi-narazint termelő Streptomyces aureofaciens törzset süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülmények között előnyös összetételű táptalajon addig tenyésztünk, míg jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel. Az antibiotikumot különböző elkülönítési és tisztítási lépések során különítjük el, amelyek a szakemberek körében jól ismertek. A dezoxi-narazin antibiotikumok előállítására használható mikroorganizmust a Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 mikroorganizmus N-metil-N’-nitrozo-guanidinnel kivitelezett mutációs kezelésével állítottuk elő. Azokat a rendszertani vizsgálatokat, amelyek szerint a Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 mikroorganizmust Streptomyces aureofaciens Duggar törzsnek találták, a 4 038 384 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban találhatjuk meg. A dezoxi-narazin antibiotikumok előállítására felhasználható Streptomyces aureofaciens tenyészetet a Northern Regional Research Center, US. Dept, of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61 604, törzsgyűjteményében letétbe helyeztük, ahonnan az NRRL 11 181 sorszámon megkapható. Az NRRL 11181 számú mikroorganizmust a Streptomyces aureofaciens törzsből izoláltuk és mutáltuk, amelyet eredetileg Törökországban az Ararát hegyen gyűjtött földmintából izoláltunk. Az eredeti földmintát agar-lemezeken szélesztettük, majd szubkultúrákat készítettünk a mikroorganizmusnak az agar-lemez felületén kinőtt telepeiről. Az egyik izolátum, amit az eredeti földminta szélesztése után különítettünk el, az NRRL 5758 jelű törzs volt. A fenti természetes szelekció után kapott törzset ismét szélesztettük és egyetlen telepet választottunk ki. Ezt a természetes szelekciót nyolcszor megismételtük, majd a 9. generáció egyik különálló telepét további szelekciós kísérletekre kiválasztottuk. A 9. generációból választott törzset olyan kémiailag meghatározott összetételű agart tartalmazó táptalajon tenyésztettük, amely szénforrásként galaktózt tartalmazott. A spórák felszabadítására ultrahanggal kezeltük az agaros táptalajt, majd spóraszuszpenziót készítettünk. A spóraszuszpenziót Whatman No. 1. szűrőpapíron szűrtük a micélium-fragmentek elválasztására. Ezután komplex folyékony halmazállapotú, 8.8 pH-jú táptalajon tenyésztettük a spóraszuszpenziót, amely milliliterenként 2 mg N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidint tartalmazott. A tenyésztést 30 °C hőmérsékleten 72 órán át végeztük. Ezután összegyűjtöttük a sejteket, és szövethomogenizálóban homogenizáltuk. Megfelelő hígítás után agar-lemezekre oltottuk a homogenizált tenyészetet, majd 30 °C hőmérsékleten addig tenyésztettük, míg egymástól elkülönülve telepek fejlődtek ki. Az egyik telepet kiválasztottuk,új tenyészetet készítettük belőle, és NRRL 8092 számmal jelöltük. Az NRRL 8092 sorszámú tenyészetet kémiailag meghatározott összetételű agart tartalmazó táptalajon tenyésztettük, amelyhez szénforrásként glükózt adtunk. Az agaros táptalaj ultrahangos kezelésével spórákat és micéliumdarabkákat tartalmazó szuszpenziót készítettünk. Ezt követően a spórák és a micéliumdarabok keverékéből álló szuszpenzióhoz milliliterenként 2 mg N-metil-N’- nitro-N-nitrozo-guanidint adtunk, majd komplex folyékony halmazállapotú, 8.8 pH-jú táptalajban 96 órán át 30 °C hőmérsékleten rázóasztalon tenyésztettük. Ezután összegyűjtöttük a tenyészetet, homogenizáltuk, és a fentiekben megadott módon eljárva agárlemezekre oltottuk. Az agar-lemezeken kinőtt telepek közül az egyiket kiválasztottuk és NRRL 11181 sorszámmal láttuk el. A szakemberek tudják, hogy ezen leírás ismeretében lehetségessé vált a Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 mikroorganizmushoz lényegében hasonló bioszintetikus képességekkel (azaz a 20-dezoxi-narazin és a 20-dezoxi-epi-17-narazin termelésére képes) további törzsek előállítása oly módon, hogy a Streptomyces aureofaciens NRRL 5788, NRRL 8092 vagy a NRRL 11 181 törzseket mutációs kezelésnek vetjük-alá. Bár a Streptomyces aureofaciens NRRL 11 181 mikroorganizmus előállítására N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidint használtunk, hasonló mutációs hatást érhetünk el például ultraibolya sugarakkal, Röntgen-sugarakkal, nagyfrekvenciás hullámokkal, radioaktív sugarakkal, vagy más vegyületekkel. A találmány egyik tárgya ezért eljárás dezoxi-narazin antibiotikum-komplex előállítására oly módon, hogy az NRRL 11 181 törzzsel gyakorlatilag hasonló bioszintetikus képességekkel rendelkező Streptomyces aureofaciens mikroorganizmust tenyésztünk. A Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 mikroorganizmus tenyésztéséhez többféle táptalajt használunk. A termelés gazdaságossága, a legjobb kitermelés és a könnyű elkülönítés érdekében azonban előnyös bizonyos adott összetételű táptalajokat használni. A nagyméretű fermentációkkor szénhidrát-forrásként előnyösen például tápióka dextrint vagy szacharózt használunk, bár használható a glükóz, kukoricakeményítő, fruktóz, mannóz, maltóz, laktóz és mások is. Használhatjuk szénforrásként a kukoricaolajat, mogyoróolajat, szójababolajat és halolajat is. Nitrogénforrásként előnyösen enzimesen hidrolizált kazeint adunk a táptalajhoz, de használhatók a peptonok, a szójaliszt, a gyapotmagliszt, különböző ami-5 10 15 20 2'5 30 35 40 45 50 55 60 65 4
