179013. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-35512 antibiotikum-keverék előállítására
39 179013 40 lásig folyékony nitrogén gőzfázisban a következők - szerint tárolhatjuk: Kistérfogatú (13x100 mm) sterilizált csavaros csőbe 2 ml, az alábbiakban megadott összetételű elegyet helyezünk: Glicerin 20% Laktóz 10% Víz (desztillált) 70% Ehhez az elegyhez 2 ml, a fentiekben megadottak szerint tenyésztett, 48 órás vegetatív tenyészetet adunk. Az összekevert szuszpenziót megfagyasztjuk, és egy folyékony nitrogént tartalmazó tartály gőzfázisába helyezzük. Az így tárolt vegetatív tenyészetet rázott táptalaj vagy tankfermentorban sterilezett táptalaj oltása előtt 43 °C hőmérsékletű vízfürdőbe helyezzük. A felolvadt szuszpenzió 1 milliliterével 50 ml, az 1. példa A) pontjában megadott összetételű, 50 ml térfogatú vegetatív táptalajt oltunk. A beoltott vegetatív tenyészetet használjuk, ahogy azt az 1. példában megadtuk, akár rázott tenyészet, akár nagytérfogatú tankfermentor oltására használt inokulum inokulálására. 3. példa Az 1. példában megadottak szerint fermentálunk, azzal a különbséggel, hogy a rázott tenyészethez és a tankfermentor termelő táptalajához a következő anyagokat keverjük: Tápióka-dextrin 75,0 g/liter Melasz 40,0 g/liter Oldható húspepton 15,0 g/liter Magnéziumszulfát ‘7^0 0,5 g/liter Kalciumkarbonát 2,0 g/liter Víz 1 literre. 4. példa Az A-35 512 antibiotikum-keverék elkülönítése 1000 liter, az 1. példában megadottak szerint előállított tény észlevet szűrési segédanyag (Hyflo Super-cel, diatomaföld, Johns-Manville Products Corp.) adagolása után szűrünk, a tenyészlé pH-ja 6,8-7,2. Az átlátszó szűrletet 100 ml szűrletre számítva 10 ml polimer adszorbenst (Amberlite XAD—4, Rohm and Haas Co.) tartalmazó kromatografáló oszlopon vezetjük át, percenkénti 150 ml-es sebességgel. A kapott frakciókat az ismert papírkorong-mérésí módszerrel, Sarcina lutea-val szemben, a biológiai aktivitás meghatározására vizsgáljuk. A biológiai inaktív effluenseket kiöntjük. A szűrt lé 1/8 térfogatának megfelelő vízzel mossuk az oszlopot, a mosás sebessége 150 ml/perc. Az inaktív vizet kiöntjük. Ezt követően 600 liter 50%-os vizes metanollal eluáljuk az oszlopot, az eluálás sebességét 200 ml/perc-re állítjuk be. Az A-35 512 antibiotikum-keveréket tartalmazó eluátumokat csökkentett nyomáson kivitelezett desztillációval 15 liter térfogatra töményítjük, amikor literenként 200 g A-35 512 antibiotikum-keveréket kapunk. 5. példa Az A-35 512 antibiotikum-keverék komponenseinek elkülönítése A 4. példában megadottak szerint kapott A—35 512 antibiotikum-keveréket (körülbelül 3000 g, 15 liter metanolban oldva) 100 liter poliamid gyantából (Woelm) készített oszlopon kromatografáljuk. 80-120 ml/perc átfolyási sebesség mellett ionmentes vízzel eluáljuk az oszlopot. A frakciók antibiotikum-tartalmát cellulóz vékonyrétegkromatográfiával vagy papírkromatográfiával összekötött, Sarcina lutea-val kivitelezett bioautográfiával határozzuk meg, oldószerelegyként n-butanol : piridin : ecetsav : víz 15 : 10 : 3 :12 arányú elegyét használjuk. Az első 100 liter térfogatú eluátumot kiöntjük. Ezután 160—200 ml-perc-re növeljük az átfolyási sebességet, ugyanakkor 12 liter térfogatú frakciókat gyűjtünk. Ily módon 20 frakciót különítünk el. Ezután az eluáló oldószert vízből és metanolból készült grádiens elúciót biztosító oldószereleggyel cseréljük fel, a következők szerint: 360 liter metanolt tartalmazó tartályt összekapcsolunk egy másik, 120 liter vizet tartalmazó tartállyal. A vizet tartalmazó tartályból a keveredő oldószerelegyet keverés közben az oszlopra engedjük. Az átfolyási sebességet 200—300 ml/perc-re állítjuk be, miközben 24, egyenként 24 liter térfogatú frakciókat gyűjtünk. A bioautográfia eredményei alapján egyesítjük a frakciókat, csökkentett nyomáson szárazra pároljuk őket, amikor A—35 512 B dihidrogénkloridot és a következő faktorokban gazdag keverékeket kapjuk: Frakciók Térfogat (1) Komponens(ek) Súly 1-10 120 A+ H 192 g 11-24 216 B 269 g 25-31 168 B + C 590 g 32-44 312 C, E, F, G 224 g 6. példa Az A—35 512 B komponens tisztítása Az 5. példában megadottak szerint előállított részlegesen tisztított, 400 g súlyú A—35 512 B komponens dihidrogénklorid sót 1,2 liter 50%-os vizes metanolban oldjuk, és az alábbiak szerint készült alumíniumoxid oszlopon kromatografáljuk: 10 kg savas alumíniumoxidot (Woelm) 50%-os vizes metanolban keverünk. Állni hagyjuk a szuszpenziót, majd dekantáljuk és kiöntjük a felülúszót. Ismét 50%-os vizes metanolt adunk az alumínium-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
