179013. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-35512 antibiotikum-keverék előállítására
41 179013 42 oxidhoz, felkeverjük és 13,5 cm átmérőjű oszlopba töltjük. 50%-os vizes metanollal addig mossuk az alumíniumoxid oszlopot, míg tiszta effluenst kapunk. 50%-os vizes metanollal, 8—10ml/perc átfolyási sebesség mellett eluáljuk az oszlopot, miközben 240—300 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiával kapcsolt, az 5. példában megadottak szerint kivitelezett bioautográfiával vizsgáljuk. Ezen adatok alapján egyesítjük a frakciókat, amiután tiszta A—35 512 B dihidrogénkloridot kapunk: Frakciók Súly 17-21 9,6 g 22-29 72,0 g 30-37 117,0 g Ezeket a termékeket 50%-os vizes metanolban oldjuk, és koncentrálás közben, 4 °C hőmérsékleten kikristályosítjuk. Az így előállított A—35 512 dihidrogénklorid körülbelül 4,6% klórt tartalmaz. Abban az esetben, ha az A—35 512 B dihidrogénkloridot 66%-os vizes dimetilformamidban oldjuk, 6,5 pH-jú oldatot kapunk. 7. példa Ionos klórtól mentes A—35 512 B előállítása A 6. példában megadottak szerint előállított tiszta A—35 512 B dihidrogénklorid 1 grammnyi mennyiségét 40 ml vízben oldjuk, majd 2,5 x 18 cm méretű ioncserélő oszlopon (Bio—Rad AG3—4X, hidroxil-ciklus) vezetjük át, az átfolyási sebességet 0,5 ml/perc-re állítjuk be, az eluálást ionmentes vízzel végezzük. Az első 5 ml térfogatú eluátumot kiöntjük. Az ezután összegyűjtött 50 ml térfogatú eluátumot csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor száraz desztilláció maradékként 0,76 g ionos klórtól mentes A—35 512 B komponenst kapunk, a termék fehér színű por, amely közelítőleg 1,59% klórt tartalmaz. Abban az esetben, ha ezt az ionos klórtól mentes A—35 512 B-t 66%-os vizes dimetilformamidban oldjuk, az oldat pH-ja 9,13 lesz. 8. példa Az A—35 512 A komponens tisztítása Az 5. példában megadottak szerint előállított (1 — 10. frakciók) részlegesen tisztított A-35 512 A komponens dihidrogénklorid só 1 grammnyi mennyiségét 5 ml 50%-os vizes metanolban oldjuk. Az oldatot 3 x 16 cm méretű, savas alumíniumoxidból (Woelm) készült oszlopon kromatografáljuk, az oszlopot az 5. példában megadottak szerint készítjük el. Az oszlopot 50%-os, percenként 0,5 ml sebességgel átfolyó vizes metanollal eluáljuk. 5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk, minden egyes frakciót vékonyrétegkromatográfiával kapcsolt bioautográfiával vizsgálunk, ahogy azt az 5. példában ismertettük. Ezen vizsgálatok alapján a 7-15. frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson kis térfogatra töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 0,3 g A—35 512 A dihidrogénkloridot kapunk (klór-tartalom 4,71%). 9. példa Az A-35 512 A komponens ionos klórtól mentes alakjának előállítása A 8. példában megadottak szerint előállított A—35 512 A dihidrogénklorid só 200 mg-nyi mennyiségét 10 ml vízben oldjuk. Az oldatot 1,5 x 10 cm méretű ioncserélő oszlopon (Bio-Rad AG3—4X, hidroxil-ciklus) vezetjük át, az átfolyási sebesség 0,5 ml/perc, az eluálást ionmentes vízzel végezzük. Az első 10 ml térfogatú eluátumot kiöntjük. Az ezután lecsepegő 20 ml térfogatú oldatot csökkentett nyomáson kis térfogatra desztilláljuk, majd fagyasztva szárítjuk, amikor 115 mg ionos klórtól mentes A—35 512 A komponenst kapunk. 10. példa Az A—35 512 C komponens tisztítása Az 5. példában megadottak szerint előállított, részlegesen tisztított, 15 g súlyú A-35 512 C dihidrogénklorid sót (25-31. frakciók) 40 ml ionmentes vízben oldjuk. 4 x 115 cm méretű poliamid oszlopon (MN, kisebb mint 0,07 mm, Brinkman Instruments, Inc., vízzel mossuk éjszakán át) kromatografáljuk. Ionmentes vízzel, 3 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk az oszlopot. Az első 250 ml térfogatú effluenst kiöntjük, ezután 24 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az összegyűjtött frakciókat vékonyrétegkromatográfiával kapcsolt bioautográfiával vizsgáljuk. A vékonyrétegkromatográfiát cellulóz lapokon (alumínium lemezeken, Merck, Németország) végezzük, futtató elegyként szekunder butanol : piridin : ecetsav : víz 10 : 10 : 3 : 8 arányú elegyét, tesztmikroorganizmusként Bacillus subtilis-t használunk. A vékonyrétegkromatográfiás eredmények alapján az 1-33. frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk az oldatot, a 150 ml térfogatú desztillációs maradékot fagyasztva szárítjuk. Hasonló körülmények között két további részlegesen tisztított A-35 512 C dihidrogénklorid sóból álló terméket kromatografálunk. Minden esetben egyesítjük az 1-33. frakciókat, csökkentett nyomáson 150 ml térfogatra töményítjük, majd fagyasztva szárítjuk. A három fagyasztva szárított mintát egyesítjük, amikor 12,3 g részlegesen tisztított A-35 512 C dihidrogénkloridot kapunk. Az így előállított terméket egy másik poliamid oszlopon kromatografálva (a kromatográfiát az előzőekben megadottak szerint végezzük) tovább tisztítjuk, ebben az esetben 15 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk, az átfolyási sebességet pedig 1 ml/perc-re állítjuk be. Az eluátumokat vékonyrétegkromatográfiával kapcsolt bioautográfiával vizsgáljuk. Egyesítjük a 36-58. frakciókat, csökkentett nyomá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
