178404. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magas heparintartalmu szervkivonatok előállítására
3 178404 4 Az autolízissel dolgozó kivonatolási módszer hátrányait a 148 776 számú magyar és a 2 587 924 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti. A hátrányok kísérleti tapasztalatok alapján több okra vezethetők vissza: — Feltételezve azt, hogy a kivonatolás során az extraháló oldat és az extrahálandó szerv között egyensúlyi állapot alakul ki, ennek ellenére a kivonatolt szerv magas nedvességtartalma miatt jelentős heparinveszteséggel kell számolni. Az extrahált szerv eltávolításával ugyanis a rendszerből szükségszerűen nedvességet (heparinoldatot is) e! kell távolítani. A közeg különböző autolizáltsági foka miatt nem mindenkor következik be egyensúlyi állapot az extrahálandó szerv és az extraháló folyadék között, ilyenkor a veszteség értelemszerűen nagyobb. — Az autolízist megelőző szervtároiási folyamat, valamint az autolízis alatt a heparint károsító mikroorganizmusok elszaporodnak, ebből fakadóan a kitermelés csökken, a bakteriális szennyeződés egyéb szempontból is (parogenitás, toxicitás) hátrányos. — Az autolízissel dolgozó módszerek egyik fő problémája a szervgyűjtésből származik és ez okozza a kapott kivonat bizonytalan összetételét. A képződött nagy térfogat miatt a feldolgozás e fázisához szükséges berendezésigény is jelentős, [pari szempontból az eljárás végrehajtása csak akkor lehetséges, ha a térfogatot akként csökkentik, hogy legalább 1—10% tisztaságú heparintartalmú köztiterméket eredményezzen. Az öszszetétel ingadozások miatt a kapott termék minősége változó, gazdaságos gyártás csak nehezen valósítható meg. A második kivonatolási módszer abban foglalható össze, hogy a heparintartalmú szervek hatóanyagtartalmát csak vegyszerek felhasználásával tárják fel a heparin vagy a heparinfehérje-komplex oldatba vitelével. Ezeket az eljárásokat például a 148 776 és a 149 339 számú magyar, a 992 201 számú brit, a 2 623 001 és a 3 058 884, valamint a 3 262 854 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetik. A vegyszeres kivonatolásnál hátrányt jelent azonban, hogy hasonlóan az autolízises módszerekhez, a rendszerből a nagy nedvességtartalmú szervmaradékokat el kell távolítani, ezáltal 20—40%-ot kitevő jelentős heparin veszteséget kell számításba venni, függően a kivonatolási maradék szerves szárazanyag koncentrációjától (vö. 148 776 számú magyar szabadalmi leírás példája és a 992 201 számú brit szabadalmi leírás). Ezen módszernél is kedvezőtlen a felhasznált szervek összetételváltozása, ami szintén változó kivonatösszetételt, a további feldolgozásban reprodukciós bizonytalanságot okoz. E nehézségek miatt például a 2 623 001 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás a feltárást követően nagy térfogatban végez hosszadalmas dialízist. A 3 262 754 számú amerikai egyesüít államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módszer a kivonatolás legnagyobb térfogatban végzett fázisaiban kényszerűségből szerves oldószert alkalmaz. Összefoglalva az autolízist alkalmazó első csoportba és a csak vegyszeres kivonatolással dolgozó második csoportba tartozó módszereket, közös hátrányként jelentkezik, hogy az extrakció folyamán — amely rendszerint az általánosan eddig alkalmazott nyersanyagok konzisztenciája miatt csak egy vagy két lépésben végzett egyenáramú művelet lehetett — végeredményben heparínra nézve rendkívül híg, 10—20 NE/ml, átlagosan 0,01% heparinkoncentrációjú, sok kísérő és zavaró szennyezést tartalmazó oldatok képződnek. Más szavakkal kifejezve 1000 MNE (6,5 kg) heparin oldatba viteléhez 50 000—100 000 literes térfogatban kell a kivonatolást elvégezni legalább 20%-os heparinveszteség mellett. A kivonatolási módszerek harmadik csoportja a heparinveszteségek csökkentésére és az előautolízis bizonytalanságának kiküszöbölésére a heparintartalmú szerveket vegyszereken kívül csaknem teljes vagy teljes feloldásig terjedő intenzív és hosszadalmas proteolízisnek veti alá a rendszerbe kívülről bevitt enzimek, mint tripszin, pankreász-kivonat, papain, elasztáz segítségével. Ilyen eljárások például a 147 323 számú magyar, a 2 587 924, 2 989 438 és a 3 817 924 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, továbbá az autolízis és enzimes proteolízist kombináltan alkalmazó 2 884 358 és 3 016 331 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban vannak ismertetve. A fennálló előnyök ellenére az utóbbi kivonatolási folyamat gazdaságosságát érzékenyen érinti a szerv fajlagos mennyiségére szükséges proteolitikus enzim költsége. 2 kg heparintartalmú szervhez például az említett eljárások egyikében 1,5—3 kg pankreász, illetve pankreász-maradék bevitele szükséges. Ha az enzimek fajlagos mennyiségét csökkentik, akkor a proteolízis és a szűrési folyamat rendkívül hoszszadalmassá válik. A 3 817 831 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban a pepszines autolízis 24 óra hosszat, a pankreatinnal végzett autolízis 15 óra hosszat tart, amelyet követően először durva, majd 24 óra múlva ultraszűrést kel! alkalmazni. Külön hátrányt jelent az is, hogy az elhúzódó folyamatok fokozzák a bakteriális szennyeződés veszélyét, a kívülről bevitt enzimekben levő, a heparin glükozidos kötéseit bontó vagy egyéb degradáló enzimek jelenléte pedig a heparin elbomlását fokozza. A teljes vagy csaknem teljes proteolízis következtében oldatba kerülnek azok az állati szervekben jelenlevő heparint kísérő komponensek, így a muco-poliszacharid típusú vegyületek, nukleinsav-származékok, színezékek, zsírok és lipoidok, amelyek a gyors és hatékony továbbfeldolgozást nagymértékben megnehezítik. A 3 817 831 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban a III. példa tanúsága szerint a B jelű oldatban a proteolízis és a durvaszűrés befejezése után 0,027% heparintartalomra 10,35%, tehát három nagyságrenddel magasabb szerves szárazanyag-tartalom jut. A hatóanyagtól mentesített feldolgozott oldatok kanalizálása is emiatt környezetvédelmi okokból problémát jelent. A proteolízissel dolgozó eljárások terméke rendkívül híg, 6—45 NE/ml (0,004—0,03%) koncentrációjú oldat, ennél töményebb oldatban a proteolízis a fellépő szubsztrát-inhibíció miatt nem hajtható végre. Az állati szervek kivonatolása, vagyis a bennük levő heparintartalom oldatba vitele és a képződött oldatok térfogatának jó hatásfokú reprodukálhatóan kivitelezhető csökkentése a gyógyszeripari termék előállítása céljából a teljes gyártási folyamat leghosszadalmasabb és legbonyolultabb szakasza. A kivonatolás hosszú időt vesz igénybe a proteolízis és/vagy a több lépésben kivitelezett kémiai-fizikai műveletek sorozata miatt, költséges, mert rendkívül alacsony hatóanyagkoncentráció miatt igen nagy térfogatú berendezések létesítése és üze5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
