178359. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 jelű antibiotikum előállítására
17 178359 18 son 200 térfogatrészre koncentráljuk. A petroléter hozzáadása után a csapadékot szűréssel elkülönítjük (28 súlyrész). A fenti terméket egy szilikagél oszlop segítségével tisztítjuk, és így 8,0 súlyrész II képletű terméket kapunk. 5. példa 10 térfogatrész etilacetátban feloldunk 1,5 súlyrész II képletü nyers terméket, amelyet a 3. példában kaptunk, majd az oldatot jól elkeverjük 4 súlyrész szilikagéllel (Merck, NSZK, 0,05—0,2 mm). Az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy 300 térfogatrészes szilikagél oszlop tetejére, és az oszlopot először 500 térfogatrész kloroformmal mossuk, majd 500 térfogatrész 20: 1 arányú kloroform-metanol eleggyel és 10:1 térfogatarányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. Az eluátumokat 25 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtjük. Mindegyik frakció 0,5 térfogatrésznyi mennyiségét csökkentett nyomáson koncentráljuk. A kapott koncentrátumhoz 0,05 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet, mint mintát szilikagél vékonyrétegkromatográfiás eljárással vizsgáljuk (előhívó rendszer 9: 1 arányú kloroform-metanol elegy). Az Rf 0,50—0,60 zónában 2537 Á-nél abszorbeáló 39 és 40 számú frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékhoz 2 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ily módon 0,150 súlyrész C—15 003 antibiotikum kristályt nyerve. A fenti 0,150 súlyrész C—15 003 antibiotikum kristályt feloldjuk 15 térfogatrész metanolban, majd 0,300 súlyrész nátriumkloridot és 15 térfogatrész vizet adunk az elegyhez. Egy oszlopot megtöltünk 200 térfogatrész Diaion HP—10-zel (Mitsubishi Kaséi K. K.) és 600 térfogatrész, 50%-os metanol-víz eleggyel kalibráljuk, amely 5% nátriumkloridot tartalmaz. A fenti módon előállított minta oldatokat átengedjük az oszlopon és gradiens technikával eluálunk, 1500 térfogatrész 60% - os, 5% nátriumkloridot tartalmazó metanol-víz elegygyel és 1500 térfogatrész 95%-os metanol-víz eleggyel. Az eluátumokat 15 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtjük és valamennyi frakciót megvizsgáljuk szilikagél vékonyrétegkromatográfiával. A 145—153 frakciók C—15 003 P—3, a 167—180 frakciók a C—15 003 P—3' és a 185—190 frakciók a C—15 003 P—4 antibiotikumot tartalmazzák. Valamennyi frakciót koncentráljuk, csökkentett nyomáson. A koncentrátumhoz 0,05 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyből vett mintát szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk, előhívórendszerként kloroform és metanol 9: 1 arányú elegyét használva. Az Rf 0,50—0,60 zónában 2537 Á-nél abszorbeáló 39 és 40 frakciókat összegyűjtjük és szárazra pároljuk csökkentett nyomáson. A maradékhoz 2 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet állni hagyjuk, igy 0,150 súlyrész C—15 003 antibiotikum kristályt állítva elő. A kapott 0,150 súlyrésznyi mennyiségű C—15 003 antibiotikum kristályokat feloldjuk 15 térfogatrész metanolban, majd 0,300 súlyrész nátriumkloridot és 15 térfogatrész vizet adunk hozzá. Egy oszlopot megtöltünk 200 térfogatrész Diaion HP—10-zel (Mitsubishi Kaséi K. K.) és 600 térfogatrész 50%-os metanol-víz eleggyel kalibráljuk, amely 5% nátriumkloridot tartalmaz. A fenti módon elkészített mintaoldatot átengedjük az oszlopon, majd gradiens eluálást végzünk, 1500 térfogatrész 60%-os, 5% nátriumkloridot tartalmazó metanol-víz elegyet és 1500 térfogatrész 95%-os metanol-víz elegyet használva. Az eluátumot 15 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtjük össze és minden egyes frakciót megvizsgálunk vékonyrétegkromatográfiás eljárással, szilikagél hordozón. A 145—153 frakciók a C—15 003 P—3-at, a 167—180 frakciók a C—15 003 P—3'-atésaP—4 elegyét, míg a 185—190 frakciók a C—15 003 P—4-et tartalmazzák. Valamennyi frakciót koncentráljuk és feloldjuk, 50 térfogatrész víz és 100 térfogatrész etilacetát hozzáadásával. Az oldatokat egy elválasztó tölcsérben összerázzuk és a vizes réteget elkülönítjük, kétszer 50 térfogatrész vízzel végzett mosás után, az etilacetátos réteget vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk, koncentráljuk és állni hagyjuk. A fenti módon valamennyi frakciókból kristályokat kapunk. A kristályokat szűréssel összegyűjtjük és szárítjuk. C—15 003 P—3 0,070 súly rész C—15 003 P—3', P—4 0,018 súlyrész C—15 003 P—4 0,015 súlyrész AC—15 003 P—3' és P—4 (0,018 súlyrész) elegykristályait feloldjuk 0,3 térfogatrész etilacetátban és szilikagél üveglemezen (Merck, NSZK, Kieselgel 60 F 254 0,25 mm, 20 x 20) az alsó széltől számítva 2,5 cm-re egy foltot kapunk, amelyet etilacetát és metanol 19: 1 arányú elegyével hívunk elő. Az előhívás után körülbelül 18 cm-ig, az Rf 0,68 (P—4) és az Rf 0,65 (P—3') abszorpciós sávokat összegyűjtjük és egymástól függetlenül kétszer egy kis mennyiségű vizet tartalmazó etilacetáttal extraháljuk. A kapott etilacetátos extraktumot vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk, csökkentett nyomáson koncentráljuk és állni hagyjuk. A C—15 003 P—4 kristályokból 0,01 súlyrész, a C—15 003 P—3' kristályokból pedig 0,003 súlyrész mennyiséget kapunk az Rf 0,68 és Rf 0,65 frakciókból. 6. példa 1000 térfogatrész 2. példa szerinti tenyészetet egy 200 000 térfogatrész méretű, rozsdamentes tartályba oltunk, amely 100 000 térfogatrész oltótenyészet táptalajt tartalmaz és a beoltott táptalajt 28 °C-on, levegőztetés mellett (100 000 térfogatrész/min) és keverés (200 fordulat/perc) 48 órán át inkubáljuk. A kapott oltótenyészetet egy 2 000 000 térfogatrész méretű rozsdamentes acélból készült tartályba visszük, amely 1 000 000 térfogatrész az 1. példában leírthoz hasonló fermentlét tartalmaz. Az átvitel sebessége 10%. A tenyésztést 28 °C-on, levegőztetés mellett (1 000 000 térfogatrész/perc) és keveréssel (120 fordulat/perc) végezzük, a belső nyomást 1 kg/cm2 értéken tartva. A tenyésztés ideje 90 óra. A kapott tenyészet titerét 20 [ig/ml-nek találtuk az 1. példában leírt eljárással vizsgálva. A fenti tenyészet 900 000 térfogatrésznyi mennyiségéhez 900 000 térfogatrész acetont adunk és egy órás 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
