178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
19 178052 20 tokát végzünk. A kísérletek során a centrifugált fermentlé felülúszó rétegét használjuk. Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza: Rázási idő (óra) 48 53 72 pH 6,7 6,4 5,5 Aktivitás (ATCC 6538 P-vel szemben) 38 40 38 mm 53 óra elteltével 13 lombikból származó férmentiét egyesítünk és szűrünk. A szűrlet 400 nù-ének pH-értékét híg sósav-oldattal 4,8-ra állítjuk be, majd ezt a folyadékot 140 ml Dowex 50x2, nátrium-ion-ciklusban levő (polisztirol-divi- 15 nilbenzol-szuifonsav alapú) gyantán 14ml/perc sebességgel adszorbeáltatjuk. Az adszorbeált anyagot 200 ml ionmentes vízzel mossuk, majd 2%-os vizes piridinnel eluáljuk és ó db 70 rtú-es frakciót gyűjtünk össze. A frakciók pH-értékét 7,0-ra 20 állítjuk. Valamennyi frakciót megvizsgáljuk, az eredményeket a következő táblázat foglalja össze: Hígítás Zónaátmérő 1 :4 33 m 30 1 :8 30 mm 1 :16 27 mm 1 :32 24 mm 35 Egy, a Streptomyces cattleya liofllizált tenyészetét tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitunk és tartalmát 0,8 ml steril Davis-sóoldatot tartalmazó kémcsőbe visszük át. A Davis-sóoldat összetétele a következő: 3. példa nátrium-citrát 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 7,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 3,0 g ammónium-szulfát 1,0 g magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1 g desztillált víz 1000 ml Ezzel a szuszpenzióval 4 ferde tenyészetet - A táptalaj (plusz agar) - oltunk be. Az A táptalaj összetétele a következő: A táptalaj élszető-autolízis termék (Ardaminex) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfát-puffer oldat 2,0 ml magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz 1000 ml xArdamine: a Yeast Products Corporation terméke Foszfát-puffer oldat kálium-dihidrogén-foszfát 91,0 g dinátrium-hidrogén-foszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml Eluált frakciók (1—6.) Hígítás 1., 1:5 2., 1 :5 3., 1 :5 4,5 és 6., 1 :5 Zónaátmérő 22,5 mm 36 mm 20 mm 0 mm 40 Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az 45 aktív anyag 45%-a az eluátumokban van jelen. A 2-es eluátum-frakcíót liofilizáljuk és így 117 mg szilárd anyagot kapunk. A fent kapott 117 mg szilárd anyagot 1,5 ml 1 :99 arányú n-butilalkohol : víz elegyben oldjuk. 50 Az oldatot 1,4x81,5 cm méretű Bio-Gél P—2 típusú, előzőleg n-butilalkohol-víz-eleggyel egyensúlyba hozott oszlopra juttatjuk. A gél-oszlopot n-butilalkohol és víz elegyével 1 ml/perc sebességgel eluáljuk és 2 ml-es frakciókat fogunk fel. A ki- 55 áramló folyadékot „Mecco-matic” elnevezésű regisztráló differenciál refraktométerrel nyomon követjük. A frakciókat 1 :20 arányban hígított formában vizsgáljuk baktérium ellenes hatásra. A bioaktív csúcsot a 44—53 frakcióknál észleljük. A 60 46-49. frakciót és az 50. frakció felét egyesítjük. Az egyesített frakciókból 1 ml-t mintaként újbóli vizsgálat céljából félreteszünk és a maradékot liofilizáljuk, 4,2 mg, részben már tisztított antibiotikumot kapunk. 65 A beoltott ferde tenyészeteket 1 hétig inkubáljuk 28 °C-on, majd 4 °C-on tároljuk. A fenti ferde tenyészet spóráinak és légmi céliumainak egy adagját arra használjuk, hogy egy 50 ml A táptalajt (agar nélkül) tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikot beoltunk vele. Ezt az inokulum lombikot 28 °C-on 220 percenkénti fordulatszámú rázógéppel (5,08 cm-es löket) 2 napig rázatj'uk, mely idő alatt megfelelő növekedést érünk el. 12 db Erlenmeyer-lombikot, melyek mindegyike 250 ml C táptalajt tartalmaz, beoltunk 7—7 ml szuszpenzióval, melyet 3 oltott tenyészetet tartalmazó lombik tartalmának aszeptikus össze öntésével kaptunk. A C táptalaj összetétele a következő: kukoricaliszt desztillációs maradék szójababliszt kalcium-klorid-dihidrát magnézium-szulfát-heptahidrát kobalt-klorid-hexahidrát vas-szulfát-heptahidrát kalcium-karbonát Pölyglycol 2000 desztillált víz 20.0 g 10.0 g 15.0 g 0,5 g 0,1g 0,01g 0,01g 4.0 g 0,25 térfogat 1000 ml pH: nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be. 10
