178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
21 178052 A lombikokat 28°C-on 220 percenkénti fordulatszámú, 5,08 cm löketű rázógépen 72 óráig rázatjuk. A fermentleveket összeöntjük és egy aliquot részt vizsgálat céljából centrifugálunk. A kapott lé pH-ja 7,4 és a centrifugált lé felülúszó rétegéből vett minta gátló hatása 43 mm (zónaátmérő). A fermentlevet szűrjük, a pH-t híg sósav-oldattal 4.0- ra állítjuk be és 3000 ml-t Dowex 50 x 2 nátrium-ion-ciklusban levő polisztirol-divinilbenzol-szulfonsav-alapú gyantán 30ml/perc sebességgel adszorbeáltatjuk. Az adszorbeátumot 300 ml ionmentesített vízzel mossuk, és 2%-os piridinnel eluáljuk, majd 8 db 150 ml-es frakciót fogunk fel. A frakciók pH-ját 7,0-ra állítjuk be. A 300 ml térfogatú 2-es és 3-as egyesített eluált frakció a Dowex 50 x 2, nátrium-ion-ciklusban levő polisztirol-divinilbenzol-szulfonsav-alapú gyantára felvitt összes bioaktiv anyagnak a 48%-át tartalmazza. Az így kapott 7-es pH-jú elegy 280 ml-ét egy 40 ml-es klorid-ion-ciklusú Dowex 1x2 polisztirol-divinübenzol-alapú trimetilammónium-típusú oszloppn szűrjük. A gyantát 160 ml ionmentes vízzel mossuk. A kifolyó és átmosott frakciókat összeöntve 440 ml oldatot kapunk. Az oldat pH-ját 8,2-re állítjuk be híg nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával, csökkentett nyomáson 300 ml-re töményítjük, a pH-t 7.0- ra állítjuk be, híg sósav-oldat hozzáadásával, majd liofilizáljuk és így 189 mg szilárd anyagot kapunk. A liofílizált szilárd anyagot n-butilalkohol és víz 1 :99 arányú elegyében feloldjuk. 25 ml oldatot 200—400 „mesh” szemcseméretű (1. az 1. példában) 5xl08cm-es Bio-Gél P-2 oszlopra visszük, miután az oszlopot n-butilalkohol és víz fenti elegyével egyensúlyba hoztuk. A gél-oszlopot n-butilalkohol és ,víz fenti elegyével 6,7 ml/min sebességgel előhívjuk. A kiáramló folyadékot „Mecco-matic” elnevezésű regisztráló differenciál refraktométerrel nyomon követjük. Egy 500 ml-es előfrakció után 20 ml-es frakciókat fogunk fel. 1 :25 hígításban minden frakciót megvizsgálunk biológiai aktivitásra. A 37—42 frakcióknál észlelünk bioaktivitást, a maximum a 39-es frakciónál jelentkezik. A 38—41-es frakciókat egyesítjük. Ezt az oldatot 7-es pH-értéken 10 ml-re töményítjük, majd liofilizáljuk. A 13,5 mg liofílizált szilárd anyagnak körülbelül hatszor akkora a relatív aktivitása, mint a Bio-Gél P—2 oszlopra felvitt anyagnak az aktivitása, a Staphylococcus aureus-al lemez-diffúziós módszerrel végzett összehasonlító kísérletek alapján. 4. példa Egy, a Streptomyces cattleya liofílizált tenyészetét tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitunk és tartalmát 0,8 ml steril Davis-sóoldatot tartalmazó kémcsőbe visszük át. A Davis-sóoldat összetétele a következő: nátrium-citrát 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 7,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 3,0 g ammónium-szulfát 1 >0 g magnézium-szulfát-heptahidiát 0,1 g desztillált víz 1000 ml Ezzel a szuszpenzióval 4 ferde tenyészetet ol- 5 tunk be. (A táptalaj + agar). Az A táptalaj összetétele a következő: A táptalaj: 22 10 élesztő-autolízis termék (Ardaminex) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfát-puffer oldat 2,0 ml magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g 15 desztillált víz 1000 ml xArdamine: a Yeast Products Corporation terméke Foszfát-puffer oldat kálium-dihidrogén-foSzfát 91,0 g 20 dinátrium-hidrogén-foszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml A beoltott ferde tenyészeteket 1 hétig inkubáljuk 28 °C-on, majd 4 °C-on tároljuk. 25 Az A táptalaj 10 ml-ét aszeptikusán az egyik ilyen ferde tenyészetet tartalmazó kémcsőbe átvisszük, a spórákat és a légmicéliumokat szuszpendáljuk és a szuszpenzió 3,3 ml-ével 500 ml A táptalajt tartalmazó 2 literes Erlenmeyer-lombikot ol- 30 tünk be. Ezt az inokulum lombikot 28°C-on 160 percenkénti fordulatszámú, 5,08 löketű rázógépen 48 óráig rázatjuk, mely idő múlva megfelelő növekedést érünk el. Az inokulum lombik tenyészetet arra használ- 33 juk, hogy avval beoltunk egy 160 liter A táptalajt tartalmazó 190 literes rozsdamentes acéltartályt. Ezt a tartályt 28°C-on kevertetjük. A keverési sebesség 150 fordulat/perc, a levegő áramlási sebessége 1,41 liter/másodperc 24 óra hosszat működ- 40 tétjük a tartályt. Kívánt esetben Polyglycol 200 (Dow Chemical Corp.) habzásgátlót használunk, 0,1%-ot meg nem haladó mennyiségben. A pH-t meghatározzuk, a következő eredményekkel. 45 Tenyésztés ideje (óra) 0 12 24 pH 6,4 6,4 6,3 Ebből a tartályból az oltó tenyészet 43 literével beoltjuk a 467Uter E táptalajt tartalmazó 756 50 literes rozsdamentes acél fermentort. Az E táptalaj összetétele a következő: E táptalaj 55 keményítőcukor 25,0 g kukorica-lekvár 15jDg desztillációs maradék gyapotmag közeg 10,0 g (Pharmamedia) 5,0 g 60 kobah-klorid-hexahidrát kalcium-karbonát 0,01g (pH beállítás után) 3,0 g Polyglycol 2000 0,25 térfogat % csapvíz 1000 ml 65 pH: nátrium-hidroxiddal 7,3-ra állítjuk be. 11
