178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
17 178052 18 szójababliszt 15,0 g nátrium-citrát 4,0 g kalcium-klorid-dihidrát 0,5 g magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1g kobalt-klorid x 16H20 0,01g vas-szulfát-heptahidrát 0,01g ^Polyglycol 2000 0,25 térfogati desztillált víz 1000 ml pH: nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be. ^Polyglycol 2000: a Dow Chemical Co. terméke A fenti 15 lombikot 28°C-on 220 percenkénti fordulatszámú rázókészüléken (5,08 cm-es löket) 3 napig rázatjuk, a fermentációs ciklus során mintákat veszünk. A centrifugált fermentlével végezzük az alábbi vizsgálatot. Előtte a kező táblázat szerint állítjuk be: lé pH-ját a követ-Rázási idő (óra) 48 ATCC 6538 P elleni 53 72 aktivitás (zóna mm) 30/40 e 35/41 e 34 kezdeti pH 6,3 5,9 5,0 beállított pH — e = elmosódott sávkontúr 6,8 6,2 es tartalmát 0,8 ml steril Davis-sóoldatot tartalmazó kémcsőbe visszük át. A Davis-sóoldat összetétele a következő: 5 nátrium-citrát 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 7,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 3,0 g ammónium-szulfát 1,0 g magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1 g 10 desztillált viz 1000 ml Ezzel a szuszpenzióval 4 ferde tenyészetet — A táptalaj (plusz agar) - oltunk be. Az A táptalaj összetétele a következő: A táptalaj élesztő-autolízis termék (Ardaminex) 10,0 g 20 glükóz 10,0 g foszfát-puífer oldat 2,0 ml magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált viz 10000 ml 53 óra elteltével 13 lombik tartalmát egyesítjük. Egy aliquot részt centrifugálunk és vizsgálunk. A maradék lét leszűrjük, a pH-t 7-re állítjuk és 500 ml-t liofilizálunk, ily módon 10,7 g szilárd anyagot kapunk. Ennek a szilárd anyagnak 1,5 g-os adagját 25 ml 1 :99 arányú n-butilalkohol : víz elegyben vesszük fel. Az oldat pH-ja 7,0. Ezt az oldatot 5 x 188 cm-es Bio-Gel P-2 (200-400 „mesh” egységnyi szitanyílású), előzőleg n-butilaÚcohol-víz-eleggyel egyensúlyba hozott oszlopra visszük fel. A gél-oszlopot ugyanezzel az oldattal hívjuk elő 10ml/perc sebességgel. Egy 650ml-es előfrakciót különítünk el, majd 75, egyenként 20ml-es frakció következik. A kiáramló folyadékot „Mecco-matic” elnevezésű regisztráló differenciál refraktométerrel nyomon követjük. Valamennyi frakció antibakteriális aktivitását meghatározzuk. A tienamicint a 34—40 frakciókban találhatjuk, a maximális tienanúcin-mennyiség a 37. frakcióban jelentkezik. A 37. frakcióból 10 ml-t liofilizálunk 4 2,0 g szilárd anyagot kapunk. A kapott szilárd anyagot 5 ml vízben felvesszük vizsgálat céljából. A próba-lemezeket éjszakán át 28 °C-on inkubáljuk. Az eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza: Koncentráció Staphylococcus aureus ATCC 6538 P Zónaméret (mm) 80 /ig/ml 40 /ig/ml 20 jug/ml 10 jug/ml 30 mm 25 mm 21 mm 17 mm 2. példa Egy, a Streptomyces cattleya liofilizált tenyészetét tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitunk 25 xArdamine: a Yeast Products Corporation terméke Foszfát-puffer oldat kálium-dihidrogén-foszfát 91,0 g 30 dinátrium-hidrogén-foszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml A beoltott ferde tenyészeteket 1 hétig inkubáljuk 28 °C-on, majd 4 °C-on tároljuk. 35 A fenti ferde tenyészet spóráinak és légmicéliumainak egy adagját arra használjuk, hogy egy 50 ml A táptalajt (agar nélkül) tartalmazó 250ml-es Erlenmeyerdombikot beoltunk vele. Ezt az inokulum-lombikot 28 °C-on 220 percenkénti 40 fordulatszámú rázógéppel (5,08 cm-es löket) 2 napig rázatjuk, mely idő alatt megfelelő növekedést érünk el. 15 db 250 ml-es Erlenmeyer-lombikot, melyek mindegyike 40 ml B táptalajt tartalmaz, beoltunk 45 az inokulum-lombik tartalmának 1 ml-ével. A B táptalaj összetétele a következő: kukoricaliszt 50 desztillációs maradék szójababliszt nátrium-citrát kalcium-klorid-dihidrál magnézium-szulfát-heptahidrát 55 kobalt-kloridx 16H20 vas-szulfát-heptahidrát ^Polyglycol 2000 desztillált víz 20.0 g 10.0 g 15.0 g 4,0 g 0,5 g 0,1g 0,01g 0,01g 0,25 térfogat % 1000 ml 60 pH: nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be. ^Polyglycol 2000: a Dow Chemical Co. terméke. A fenti 15 lombikot 28 °Gon 220 percenkénti fordulatszámú rázókészüléken (5,08 cm-es löket) 3 65 napig rázatjuk a fermentációs ciklus során vizsgála-9
