178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
15 178052 16 Az adszorbeált antibiotikumot a kationcserélő gyantáról ammónia vizes oldatával vagy szerves bázisokkal, például piridinnel, pikolinokkal, lutidinekkel, kollidinekkel vagy alküaminokkal gyorsan eluálhatjuk. Az így kapott eluátumot tovább tisztíthatjuk, kívánt esetben más tisztítási módszereket is használhatunk. így például az eluátumot poliészter polimereken, például XAD-7 vagy 8-on, (poliakriiészterek) polisztirol-divinil-benzol-polimereken, például XAD—1,2-en, vagy 4-en, előnyösen XAD-2-n keresztül áramoltatjuk. (A XAD-jelű gyantákat a Rohm és Haas Co. Philadephia, Pennsylvania gyát gyártja). A tisztított tienamicin visszanyerésére előnyös módszer, ha az antibiotikum oldatát, így például a szűrt fermentlevet, melynek pH-ját 4-5 értékre állítottuk be, erős kation-szulfonát típusú nátrium-ion-ciklusban levő ioncserélő gyantán átáramoltatjuk (Dowex 50 x 2, polisztirol-divinilbenzol-polimer). Á kapott adszorbeált anyagot ezután a megfelelő eluálószerrel, például 2%-os vizes piridinnel eluáljuk. Az eluátumokat frakciókban gyűjtjük össze, a frakció mennyisége az alkalmazott oszlop nagyságán múlik. További tisztítást érhetünk el a következő polimereken végzett kromatográfiával: polisztirol-divinilbenzol-alapú trimetüammónium-típusú anioncserélő gyanta (Dowex 1 klorid-ion-ciklusban), polisztirol-divinilbenzol-alapú szulfonát-típusú kationcserélő (például Dowex 50 2,6-lutidinium-ciklusban), gél-áteresztő gyanták (például Bio-Gel P—2, poliakrilamid-típusú gyanta). Az eluátumok bioaktivitását Staphylococcus aureus ATCC 6538P tesztorganizmus felhasználásával mérjük. A találmány szerinti eljárásokat a következő példákkal ábrázoljuk. Teszt-viszgálatok A következőkben ellenkező megjegyzés hiányában mindig lemez-diffúziós módszerei végezzük el az antibakteriális aktivitás rheghatározását. A próba-tenyészeteket a következő módon készítjük. 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó táptalajban a vizsgálandó törzs Staphylococcus aureus ATCC 6538P egy éjszaka alatt kialakult növekményét 0,2% élesztő kivonatot tartalmazó táptalajjal hígítjuk és 660 m/r hullámhossznál 55% áteresztőképességű szuszpenziót kapunk. Ezt a szuszpenziót 2,0 g/1 Difco élesztőkivonattal kiegészített Difco táp-agarhoz adjuk 47-48 °C-on, és így a készítmény 33,2 ml szuszpenziót tartalmaz 1 liter agarra számítva. A szuszpenzió 5 ml-ét 85 mm átmérőjű Petri-csészékbe öntjük, majd ezeket a tenyészeteket hűtjük és a használat napjáig (max. 5 napig) 4 °C-on tartjuk. Az antibiotikum mintákat pH-7 értékű foszfát-pufferben a megfelelő koncentrációra hígítjuk. 12,7 mm átmérőjű szűrőpapír lemezeket a teszt-oldatba mártunk, majd a próba-tenyészet felületére helyezzük. Minden mintához általában 2 lemezt helyezünk el, egymással szemben egy tenyészetre. A tenyészeteket éjszakán át 37 °C-on ínkubáljuk, majd megmérjük a gátlási zóna átmérőt mm-ben. A mm-ben mért gátlási zóna relatív aktivitást ad meg, vagy ha a tisztított összehasonlító sztandarddal összehasonlítjuk, például cefalotinnal, akkor egység/ml-ben kapjuk az antibiotikum aktivitását. A 4—7. példákban az aktivitás egységét a cefalotin 8,4,2 és 1 /u/ml koncentrációjú standard oldataihoz viszonyítjuk. Egy egység definíciója: az a mennyiség, amennyi ugyanolyan gátlást hoz létre, mint 1 £ig cefalotin/ml, ennek a gátlási zónának az átmérője 16-21 mm. 1. példa Egy, a Streptomyces cattleya törzs liofilizált tenyészetét tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitnak és tartalmát 0,7 ml steril Davis-sóoldatot tartalmazó kémcsőbe visszük át, a Davis-sóoldat összetétele a következő: nátrium-citrát 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 7,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 3,0 g ammónium-szulfát 1,0 g magnézium-szülfát-heptahidrát 0,1 g desztillált víz 1000 ml Ennek a szuszpenziónak 0,2ml-ét ferde tenyészet - a táptalaj (plusz agar) — beoltására használjuk. Az A táptalaj összetétele a következő: A táptalaj élesztő-autolízis termék (Ardaminex) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfát-puffer oldat 2,0 ml magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz 1000 ml pH: nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be. xArdamine: a Yeast Products Corporation terméke Foszfát-puffer oldat kálium-dihidrogénfoszfát 91,0 g dinátrium-hidrogén-foszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml Ferde tenyészetek előállításánál 25,0 g/liter agart adunk hozzá. A beoltott ferde tenyészeteket 8 napig inkubáljuk 28 °C-on, majd 4 °C-on tároljuk. A fenti ferde tenyészet spóráinak és légmicéliumainak egy adagját arra használjuk, hogy egy 50 ml A táptalajt (agar nélkül) tartalmazó 250ml-es Erlenmeyer-lombikot beoltunk vele. Ezt az inokulum-teny észetet tartalmazó lombikot 28 °C-on 220 percenkénti fordulatszámú rázógéppel (5,08 cm-es löket) 2 napig rázatjuk, mely idő alatt megfelelő növekedést érünk el. 15 db 250ml-es Erlenmeyer-lombikot, melyek mindegyike 40 ml B táptalajt tartalmaz, beoltunk az inokulum lombik tartalmának 1 ml-ével. A B táptalaj összetétele a következő: kukoricaliszt 20,0 g desztillációs maradék 10/) g 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
