178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
23 178052 24 Ezt a tartályt 24 °C-on 95 fordulat/perc keverési sebességgel, 4,7 liter/másodperc levegőáramlási sebességgel 120 óra hosszat kevertetjük. Kívánt esetben Pölyglycol 2000 habzásgátló adalékot adunk hozzá, 0,1%-ot meg nem haladó mennyiségben. Vizsgálatokat végzünk, amelyeknek az eredményeit a következő táblázat tartalmazza: Tenyésztési. idő pH Antibiotikus aktivitás (ATCC 6538 P-vel szemben) (mm) Dextróz mg/mm 0 6,8 ____ 22 12 6,6 21,3 24 6,2 16,5 36 5,8 25 12,1 48 5,7 25 7,8 60 5,8 21,5 4,3 72 6,1 25 2,5 84 6,6 33 1,6 96 6,7 41,5 1,0 108 6,5 45 1,0 120 6,5 45 0,5 Az egész fermentlé 400 literét szürőprés és szűrési segédanyag felhasználásával leszűrjük. A szűrlethez 1,7 g (etilén-diamin)-tetraecetsav-tetranátriumsót adunk. A szűrletet 6 °C-ra lehűtjük, a pH-t 4,0 ± 0,2 értékre állítjuk be és a szűrletet 6 °C-on tartjuk. A hideg szűrletet 38 liter Dowex 50x4, nátrium-ion-ciklusban levő, 20—50 „mesh” (1.1. példában) részecskenagyságú gyantán adszorbeáltatjuk 4 liter/perc sebességgel. Az adszorbeátumot 40 liter ionmentes vízben mossuk, majd az oszlopot 2%-os vizes piridínnel eluáljuk, három ^literes frakciót gyűjtünk össze, és ezeket vizsgáljuk. A baktérium-ellenes aktivitás vizsgálata szerint a 2-es és 3-as frakciók a betáplált aktivitás 22%-át tartalmazzák. Ezeket a frakciókat egyesítjük, 3,8 literre töményítjük és a pH-t 7-re állítjuk be. A kapott 3,8 liter koncentrátumot 2,5 liter Dowex 1 x 2,50—100 „mesh” szemcseméretű klorid-ion-ciklusú polisztirol-divinilbenzol-alapú trimetüammónium-típusú gyantán 200ml/perc sebességgel adszorbeáltatjuk. A gyantát ugyanilyen sebességgel ionmentes vízzel eluáljuk. Tíz 1 literes frakciót fogunk fel, valamennyi frakció pH-ját 7-re állítjuk be. A vizsgálati eredmények szerint a bioaktív anyag 75%-át az 5—8 frakciók tartalmazzák. A frakciókat egyesítjük és 0,45 mikronos „Millipore” szűrővel szűrjük. A szűrlet 3 literét liofiiizáljuk és ily módon 16,6 g 70 egység/mg aktivitású szilárd anyagot kapunk. A liofilizált szilárd anyag 4 grammját 50 ml 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát-pufferben felvesszük. A 6,3 pH-értékű oldatot Dowex 50 x 8 oszlopra viszszük fel a következőképpen: A Dowex 50 x 8 (200-400 „mesh”) hidrogén•ion-eiklusú polisztirol-divinilbenzol-aiapú gyanta 2,5 liternyi mennyiségét 2,6-lutidin-ciklusúvá alakítjuk át és 5 oszlopnyi térfogatú 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát-pufferrel (pH 6,3) egyensúlyba hozzuk. Az egyensúlyba hozott gyanta-oszlop 5x114 cm méretű. Az oszlopot 14ml/perc sebességei 0,1 mólos pufferrel fejlesztjük ki. A kiáramló folyadékot „Mecco-matic” elnevezésű regisztráló differenciál refraktométerrel nyomon követjük. Az eluálást addig folytatjuk, ameddig 220, egyenként 20ml-es frakciót szedünk. A 44—142. frakciók közül minden második frakciót 1 :50 hígításban vizsgálatnak vetünk alá. A 78—136. frakciókban észlelünk bioaktivitást. A maximum a 92—94-es frakcióknál figyelhető meg. A 82—116. frakciókat különválasztjuk, össze öntjük, és ily módon 700 ml oldatot kapunk. Ezt az oldatot két 350 nú-es adagra osztjuk és liofiiizáljuk. A liofilizált szilárd anyag egyik adagját pH = 7 értékű 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát-pufferben oldjuk. A 27 ml-nyi oldatot 5 x 180 cm-es (200- -400 „mesh”) szemcseméretű Bio-Gel P-2 poliakrilamid oszlopra visszük fel, amelyet előzőleg 0,1 mólos pufferrel egyensúlyba hoztunk. A géloszlopot ugyanezzel a pufferrel 10ml/perc sebességgel hívjuk elő. A kiáramló folyadékot „Mecco-matic” elnevezésű differenciál refraktométerrel nyomon követjük. Az előhívást addig folytatjuk, ameddig 105 egyenként 20ml-es frakciót kapunk. Az 51-90. frakciók mindegyikét megvizsgáljuk 1 :50 hígításban. A vizsgálat eredményeként a bioaktív csúcs a 67—75. frakciókban jelentkezik, ennek maximuma a 70-es és 71-es frakcióknál mutatkozik. A 68-75. frakciókat össze öntjük és így 162 ml térfogatú oldatot kapunk, ennek 145ml-éhez 3 ml 360 mólos 7-es pH-jú nátrium-foszfát-puffert adagolunk és az oldatot 9ml-re koncentráljuk. A koncentrátumot, mely a Bio-Gel P—2 poliakrilamid oszlopra felvitt bioaktív anyag 78%-át tartalmazza, liofiiizáljuk és így 185 mg szilárd anyagot kapunk. A 68-78. frakciókból maradt 17 ml aliquot részt liofiiizáljuk és ily módon 1,9 mg 1050 egység/mg aktivitású szilárd anyagot kapunk. 5. példa Egy, a Streptomyces cattleya liofilizált tenyészetét tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitunk és tartalmát 0,8 ml steril Davis-sóoldatot tartalmazó kémcsőbe visszük át. A sóoldat összetétele a következő: nátrium-dtrát 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 7,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 3,0 g ammónium-szulfát 1,0 g magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1 g desztillált víz 1000 ml Ezzel a szuszpenzióval 4 ferde tenyészetet — A táptalaj, agarral - oltunk be. Az A táptalaj összetétele a következő: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
