177888. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentációban keletkező anyarozsalkaloidok mennyiségeinek és arányának szabályozására
5 177888 6 vagy gyengés savas-vizes oldatban, sterilezés után adagoljuk a fermentléhez. Az adagolás történhet egyszeri adagban, több adagra elosztva, vagy a fermentáció valamely periódusában folyamatosan. A fermentlevekben színreakció alapján fotometrikusan összalkaloid-tartalmat is mértünk; ezt nem tartjuk specifikusnak, de korábbi bejelentések példái gyakran adják meg a termelési szintet spektrofotometriával nyert összalkaloid értékben. A fermentáció jellemzésére az egyes ergotoxin komponenseket külön határoztuk meg eluciós kromatográfiával vagy kvantitatív folyadékkromatográfiával. Az eljárást közelebbről az alábbi példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk. 1. példa MNG 0022 számon deponált Claviceps purpurea variáns-törzs AIC agar-táptalajon nőtt tenyészetét 750 ml-es Erlenmayer lombikban levő 200 ml GK táptalajra oltjuk, majd 24 °C-on 300-as löketszámú rázóasztalon 3 napig inkubáljuk. Az így nyert inokulumot továbboltjuk 10 literes laboratóriumi fermentorban levő 5 liter St táptalajra, majd 7 napon át 24 °C hőmérsékleten 240 fordulat/perc sebességgel keverve és 0,5 liter levegő/liter fermentlé/perc levegőbeáramlási sebességgel levegőztetve fermentáljuk. A fermentáció 40., 64., 88. és 112. órájában a fermentléhez prekurzorként metiloxálecetsav 10%-os vizes oldatát adjuk esetenként 0,5 g prekurzor/liter fermentlé mennyiségben. A fermentlében az ergokomin—ergokriptin aránya a 7. napon éri el a kívánt szintet. Ekkor a fermentációt leállítjuk. A színreakcióval mérhető összalkaloid-szint 1150 y/ml. A fermentlében vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat [J. of Chrom. 87,433, (1973)] alapján 300 y/ml az ergokomin, 180 y/ml az ergokriptin-tartalom és 110 y/ml ezek jobbra forgató epimerjei. Nagy nyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat [J. Pharm. Sei. 67 98 (1978)] alapján az ergokriptin-tartalmon belül az a- és ß-ergokriptin aránya 66 ; 34. Az alkaloidokat a fermentléből ismert módon nyerjük ki. A példában alkalmazott táptalajok: AIC agar-táptalaj mannit 40,0 g citromsav 7,0 g kukoricalekvár 2,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 1,0 g magnézium-szulfát 0,3 g agar-por (Difco) 25,0 g ammónium-hidroxid ad pH 5,2—5,3 víz ad 1000 ml A táptalaj pH értékét felfőzés közben állítjuk be a kívánt 5,2—5,3 értékre, majd a táptalajt 6 ml-es adagokban kémcsövekbe töltjük, sterilezzük, ferdítjük. GK táptalaj tripkazin 7,0 g cítromsav 4,1 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,3 g magnézium-szulfát 0,3 g ammónium-hidroxid ad pH 5,7—5,8 víz ad 840 ml A táptalajt 84 vagy 168 ml-enként lombikokba töltjük, és lombikonként 16, illetve 32 ml 50%-os glukózoldatot adunk hozzá sterilen. St táptalaj szacharóz 100,0 g borostyánkősav 10,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,25 g magnézium-szulfát 0,25 g ammónium-nitrát 1,0 g kálcium-klorid 1,0 g ammónium-hidroxid ad pH 5,2—5,3 víz ad 1000 ml A táptalajt 0,1 vagy 5, vagy 100 literes adagokban sterilezzük. 2. példa MNG 0088 számon deponált Claviceps purpurea variáns-törzs AIC agar-táptalajon nőtt tenyészetét 750 ml-es Erlenmayer lombikban levő 200 ml GK táptalajra oltjuk, majd 24 °C-on 300-as löketszámú rázóasztalon 3 napig inkubáljuk. A kapott tenyészetet 10 literes laboratóriumi fermentorban levő 5 liter TC 54 táptalajra oltjuk, majd 3 napon át 24 °C hőmérsékleten 240 fordulat/perc sebességgel keverve és 0,5 liter levegő/liter fermentlé/perc levegőbeáramlási sebességgel levegőztetve inkubáljuk. Az így nyert inkulumot saválló, keverős fermentorban levő 100 liter St táptalajra oltjuk, és a tenyészetet 24 °C-on 120 fordulat/perc sebességű keverés és 0,3 liter/liter/perc sebességű levegőztetés közben 6 napig fermentáljuk. A fermentáció első 5 napján prekurzorként oc-keto-vajsav 5%-os vizes oldatát adagoljuk a fermentléhez 20 ml prekurzor-oldat/óra sebességgel. A fermentáció leállítása után az összalkaloid-szint 920 y/ml, az 1. példában megadott folyadékkromatog- * ráfiás módszerekkel meghatározva a fermentlé 260 y/ml ergokornint 155 y/ml a-ergokríptint és 95 y/ml ß-ergokriptint tartalmaz. Ezen felül 80 y/ml ergokorninin-kriptinin koncentráció mérhető. A példában alkalmazott táptalajok közül az AIC, GK és St táptalajok összetételét az 1. példában megadtuk. TC 54 táptalaj összetétele: szacharóz 100,0 g citromsav 10,0 g nátrium-klorid 10,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,5 g magnézium-szulfát 0,5 g ammónium-hidroxid ad pH 5,7—5,8 víz ad 1000 ml A táptalajt 5 literes adagokban laboratóriumi fermentorban sterilezzük. 3. példa MNG 0088 számon deponált Claviceps purpurea variáns-törzs St agar-táptalajon nőtt tenyészetét 500 ml-es Erlenmayer lombikban levő 100 ml GK táptalajra olt5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
