177888. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentációban keletkező anyarozsalkaloidok mennyiségeinek és arányának szabályozására
3 177888 4 rás, deponálási szám: ATCC 20106), ergokriptintermelő törzs (3 485 722 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, deponálási szám: ATCC 20019), ß-ergokriptint és ergozint termelő törzs (824 987 számú belga szabadalmi leírás, deponálási szám a Soc. Farmaceutici Itália saját gyűjteményben: FI 7374). A fentiekből látható, hogy ezen ismert, külföldi cégek által szelektált törzsek nemcsak az ergotoxingyártás szempontjából fontos alkaloido{ka)t termelik, hanem ergotoxintípusútól eltérő anyarozs-alkaloidokat is. A fermentáció tehát e törzsek esetében nem szelektíven ergotoxinra orientált. Elsőként magyar kutatók szelektáltak olyan Claviceps purpurea törzseket, melyek főként ergokornint, a- és ß-ergokriptint termelnek. (152 238 számú magyar szabadalmi leírás, deponálási szám: MNG 0022; és 164 816 számú magyar szabadalmi leírás, deponálási szám: MNG 0088). Ezen törzsek esetében sem megoldott azonban a termelt alkaloidok arányának fermentáció közbeni szabályozása. A három kérdéses alkaloid egymáshoz képesti aránya csak utólag állítható be: a kapott alkaloidkeveréket komponenseire bontják a rendelkezésre álló nehézkes módszerekkel, majd az egyes komponenseket megfelelő arányban újra összekeverik. Ismert továbbá két törzs egyidejű alkalmazásán alapuló eljárás (577 556 számú svájci szabadalmi leírás), melyben egy ergokornint, ergokriptint és izomereiket termelő törzset, valamint egy ergokrisztint termelő törzset tenyésztenek azonos kultúrában, és a felsorolt alkaloidokat egymás mellett nyerik közelebbről meg nem határozott arányban. Az arány beállítását tehát ez a módszer sem oldja meg. További problémát jelenthet, hogy a fermentáció kézben tartása két törzs egyidejű alkalmazása esetén sokkal nehezebb, mint ha csak egy törzs tenyésztési optimumára kell ügyelni. H. Kobel [Federation of the European Microbiological Societies 1977. évi ülésén elhangzott előadás (Bázel)] megállapította, hogy a peptidalkaloidok bioszintézise bizonyos aminosavakkal befolyásolható. Nevezetesen a peptidrészben valint tartalmazó ergokornin bioszintézisét valin adagolásával, a leucint tartalmazó aergokriptin bioszintézisét leucin adagolásával elő lehet segíteni. Az izoleucint tartalmazó ß-ergokriptin bioszintézisét ugyanakkor izoleucin adagolásával nem lehet kedvezően befolyásolni. E furcsa jelenség valószínű magyarázataként közölte, hogy az izoleucin gátolja a ß-ergokriptin termelésére képes gomba-törzsek növekedését. Minthogy az ismert ergokriptint, vagy ergokornint és ergokriptint termelő törzsek fermentlevében általában éppen a ß-ergokriptin-hänyad kisebb a szükségesnél, a megfelelő arány beállítása továbbra sem volt megoldható. Ezért célul tűztük ki, hogy a Claviceps purpurea variáns törzsekkel végzett fermentáció kedvező irányban történő befolyásolását megkíséreljük. Munkánk során meglepő módon azt találtuk, hogy ha az ismert Claviceps purpurea variáns törzsekkel végzett alkaloidtermelést izoleucin helyett az izoleucin bioszintézis-útjának valamely vegyületével próbáljuk befolyásolni, akkor a fermentlében a ß-kriptin-hänyad emelkedik. Az izoleucin elővegyületei tehát a gombatörzsek növekedését nem gátolják. Azt találtuk továbbá, hogy az alkaloidtermelés olyan vegyületekkel is megfelelően szabályozható, melyek a biokémiai szabályozás folytán serkentik az izoleucinképződést. Az elővegyületek és a szabályzó vegyületek olyan 4—6 szénatomos ketosavak, hidroxisavak és aminosavak, melyek bioszintézise az aszparaginsavból vagy annak foszfátjából indul ki. A fermentáció kedvező irányban történő befolyásolását új variáns-törzs szelektálásával is megpróbáltuk. Szelekciós kísérleteink során egy sajátos, élesztő-szerű morfológiával jellemezhető új Claviceps purpurea variáns-törzshöz jutottunk, mely törzset 1979. május 9-én 00186 MNG számon deponáltunk. E törzs főként ergokornint és ß-ergokriptint termel, a ß-ergokriptin-hänyad növelésére tehát alkalmas. Azt találtuk továbbá, hogy ha az izolált új variánstörzzsel végeztetjük az alkaloid-termelést, és közben a fermentléhez az izoleucin bioszintézis-útjának valamely vegyületét vagy az izoleucin-képződést biokémiai szabályozás útján serkentő valamely vegyületet alkalmazzuk, akkor a termelt alkaloidok aránya alig változik, ezzel szemben nő a fermentlében az alkaloidok mennyisége. A találmány tárgya tehát eljárás szaprofita körülmények között főként ergokornin, a- és ß-ergokriptin termelésére képes Claviceps purpurea variáns törzsek által termelt alkaloidok szintjének, és egymáshoz képesti arányának szabályozására, oly módon, hogy az önmagában ismert fermentációs eljárásnál szabályozóként az izoleucin bioszintézis-útjának valamely vegyületét vagy az izoleucin-képződést biokémiai szabályozás útján serkentő valamely vegyületet alkalmazzuk. A találmány értelmében a fermentációs eljárásban főként ergokornint, a- és ß-ergokriptint termelő Claviceps purpurea törzset, előnyösen MNG 0022, MNG 0088 vagy MNG 00186 számon deponált variáns-törzset alkalmazunk. A fermentációt alámerülő kultúrában, aerob körülmények között, szén- és nitrogénforrást, ásványi sókat és adott esetben egyéb adalékokat tartalmazó folyékony táptalajon végezzük. A fermentációt 20—26 °C közötti hőmérsékleten, 5,2 és 6,8 közötti pH értéken, 4—8 napon át végezzük. A fermentációt az alkaloidok arányát szabályozó adalék (prekurzor) jelenlétében végezzük. Szabályozó adalékként például az izoleucin bioszintézis-útjának valamely vegyületét [Lehninger: Biochemistry, Worth Publ. Inc. N.Y. 704 (1975)] vagy az izoleucin-képződést biokémiai szabályozás útján serkentő vegyületeket alkalmaztuk. Az izoleucin bioszintézis-útjának vegyületei és képződési sorrendjük a következők: homoszerinen és treoninon vagy 3-metil-aszparaginsavon (vagy más néven 2- amino-3-metil-borostyánkősav) és metiloxálecetsavon (vagy más néven 2-metil-3-oxo-borostyánkősav) át a-keto-vajsav, majd a-acetil-a-hidroxi-vajsav, a, ß-dihidroxi- fi-metil-valeriánsav és a-keto-ß-metil-valeriänsav képződik. Az izoleucin-képződést biokémiai szabályozás útján serkentő vegyületek biokémiailag az ún. aszpartat-családba tartoznak, azaz olyan vegyületek, melyek bioszintézise az aszparaginsavból vagy annak foszfátjából indul ki. Ezek elsősorban 4—6 szénatomos keto-savak, hidroxisavak vagy aminosavak, melyek legelőnyösebb képviselői a homocisztein és/vagy a metionin. Az alkaloid-termelést szabályzó vegyületet 0,01— 10 kg/m3, előnyösen 0,05—5,0 kg/m3 fenmentlé meoynyiségben alkalmazzuk. A szabályzó-adalékot vizes 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
