177884. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a di-O-on(n-hosszúszénláncú- alkil- vagy alkenil)-glicinek aminszármazékainak előállítására
31 177884 32 Az V. példában megadott módon meghatározzuk az ismertetett vegyületek cirkuláló interferont redukáló képességét. 6. táblázat VI. példa A vizsgált Interferon-koncentráció (E/ml)^a> yegyuiet Az injekciót követő órák száma előállítására_________________________________________ vonatkozó példa száma 8 12 16 20 13. <20 23 75 90 14. 20 71 54 68 15. <18 138 217 163 23. <20 28 60 70 43. 70° 100 120d 100® A vizsgált Interferon-koncentráció (E/ml)íb) ,y®Syule* Az injekciót követő órák száma előállítására vonatkozó------------------------------------------------------------példa száma 6 9 12 15 18 13. <13 <13 39 35 72 14. <18 <18 43 59 32 15. <13 <13 43 92 57 23. <13 <13 91 109 50 (a) interferon-forrás : plazma (b) interferon-forrás: peritoneális mosófolyadék VII. példa Az 1,3-di-0-(n-hexadecil)-2-0-(3-amino-propil)-glicerin-hidrogén-klorid növeli a poliinozinsav-policitidilsav [poli(I : G)] indukált vírusfertőzéssel szembeni sejtrezisztenciát Eagle minimál táptalaj 100 ml-ét 2 ml 100-szorosan koncentrált antibiotikum-antifungális oldattal, 1 ml 200 mM-os glutamin-oldattal és 5% hővel inaktivált borjú-szérummal kiegészítve növekedési táptalajt készítünk. Ebbe a táptalajba egér L—929 fibroblaszt sejteket szuszpendálunk, és egy 96 helyes mikrotiter lemez mindegyik lyukába 0,2 ml, 20 000—30 000 sejtet tartalmazó szuszpenziót helyezünk. 2—4 napon át 37 C° hőmérsékleten és 5% széndioxid-atmoszférában inkubálva a tenyészeteket egyrétegű sejttenyészetet hozunk létre. Foszfát puffert tartalmazó sóoldattal mossuk a lemezeket közvetlenül a kezelés után. A fenti táptalajban, amely azonban borjú-szérumot nem tartalmaz, milliliterenként 5,0, 1,0, 0,2 és 0,04 mg poli(I : C)-t oldunk. Mindegyik hígításból 0,1 ml-t nem szabályos elrendezésben rácseppentünk az L—929 sejtrétegre, majd rácseppentünk 0,1 ml-t a fenti szérummentes táptalaj milliliterében 20,0, 4,0, 0,8, 0,16 és 0,032 ug-ot tartalmazó hatóanyagból is. A kontroll lyukakba vagy poli(I : C)-t, vagy egyedül a hatóanyagot helyezzük. 6 órán át 37 C° hőmérsékleten és 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférán inkubáljuk a lemezeket, majd ezt követően négy esetben foszfát-puffért tartalmazó sóoldattal mossuk, ami után 0,1 ml 2% szérumot tartalmazó növekedési táptalajjal töltjük meg a lyukakat. További 18 órán át folytatjuk az inkubációt, majd megvizsgáljuk a sejtek toxicitási tüneteit. Ezután lyukanként 0,1 ml vezikuláris sztomatitisz vírus-szuszpenzióval (VSV) fertőzzük a tenyészeteket, az adagolt vírusszuszpenzió a TCID50-érték (50%-os szöveti fertőzést okozó mennyiség) 10—30-szorosának megfelelő vírust tartalmaz. 3—4 napon át inkubáljuk a tenyészeteket, majd a citopatogenitást mikroszkopikusan vizsgáljuk. A vírusfertőzéstől megvédett sejteken citopatogén hatást nem találunk. A minimális védő dózist (MPD) a poli(I : C) mutatja. A példa szerinti vegyülettel együtt vizsgált sejtekben növekszik vagy nagyobbodik a vírusellenes hatás, ezt mindegyik hígításra megállapítjuk. 7. táblázat A poli(I : C)-indukált vírusfertőzéssel szembeni sejtrezisztencia növekedése. A vizsgált vegyület koncentrációja (p.g/ml) 20,0 4,0 0,8 0,16 0,032 125x 125x 125x 5x s-5x Megjegyzés : Abban az esetben, ha a poli(I : C)-t a megadott vegyülettel kombinálva alkalmazzuk, úgy azonos vírusellenes hatást kapunk, mintha a poli(I : C) koncentrációját a megadott szorzóval növeljük. VIII. példa A VII. példában megadott vizsgálattal meghatározzuk az alábbi vegyületek poli(I : C)-indukált sejt-rezisztencia növelő hatását vírusfertőzéssel szemben. 8. táblázat A vizsgált vegyület előállítására vonatkozó példa száma A poli (I : C) hatásának növelése^ Koncentráció (fig/ml) 20 0,4 0,8 6. + + _ 7. + + — 13. + + + 14. + + ± 15. + + + 16. + + ± 17. + + + 18. + + + 19. + + ± 20. + ± — 21. — — — 22. + + ± 23. + + ± 24. + + — 25. + — — 26. + + — 27. + + — 28. + + — 29. + + ± 30. + + — 38. + + ± 39. + + — (a) + = >- 5x növekedés ; ± = ~ 5x növekedés ; — = < 5x növekedés. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16
