177435. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatosztatin analógok előállítására
7 177435 8 ragint para-nitrofenil-aktív észterén át építjük a peptidláncba. Ekkor a 11. reakciólépést a kővetkező 3 lépéses eljárással helyettesítjük: a) 1 g gyantára számítva 10 ml dimetilformamiddal háromszor, egyenként 3 percen át mossuk a készítményt, b) 1 g gyantára számítva 1,0 mmól N-terder-butiloxi-karbonil-L-aszparagin-para-nitrofenil-észtert adunk a reakcióelegyhez, 1 g gyantára számítva 10 ml dimetilformamid és metilénklorid 1 :3 arányú elegyében, majd 720 percen át keverjük a reakcióelegyet, végül c) lg gyantára számítva 10 nú dimetilformamiddal háromszor, egyenként 3 percen át mossuk a készítményt. A 20. reakciólépést szintén N-tercier-butiloxi-karbonil-L-aszparagin-para-nitrofenil-észterrel végezzük, amit dimetilformamid és metilénklorid 3 :1 arányú elegyében adagolunk, és a reakcióelegyet 720 percen át keverjük. Az így előállított peptid-gyantát csökkentett nyomáson szárítjuk. A termék egy részét hidrogénklorid és dioxán elegyében 72 órán át visszacsepegő hűtő alatt hidrolizáljuk. A kapott termék aminosav-analízise szerint, a mérést lizin standard mellett végezve, a következő összetételű: aszparagin: 1,04, 2. treonin: 2,68, szerin: 1,08, valin: 1,12, glicin: 1,04, 3 fenilalanin: 3,87, 2 lizin: 2,00, triptofán: 0,75. A triptofán meghatározására a termék egy mintáját dimetilszulfoxid és tioglikolsav jelenlétében 21 órán át hidrohzáltuk. A ciszteint nem határoztuk meg, mivel az az analíziskor használt eljárás közben bomlik. 3. példa A D-valil-glicil-L-ciszteinil-L-lizil-L-aszparaginil-L-fenilalanil-L-fenilalanil-L-triptofil-L-lizil-L-treonil-L-fenilalanil-L-treonil-L-szeril-L-cisztein előállítása 5 ml anizol és 5 ml etil-merkaptán elegyéhez 2,828 g (0,150 mmól) a 2. példában megadottak szerint előállított védett tetradekapeptid-gyantát adunk. Folyékony nitrogénben lehűtjük a reakcióelegyet, majd desztillációval 56 ml folyékony hidrcgénfluoridot adunk hozzá. 0°C hőmérsékletre hagyjuk melegedni a reakcióelegyet, majd 2 órán át keverjük. Desztillációval eltávolítjuk a hidrogénfluoridot, majd étert adunk a desztillációs maradékhoz. 0°C-ra hűtjük a reakcióelegyet, az elegyből kivált szilárd terméket szűréssel elkülönítjük, és éterrel mossuk. Szárítjuk a terméket, majd egy mólos ecetsav és kevés jégecet elegyével extraháljuk a védőcsoportokat már nem tartalmazó tetradekapeptidet a gyantát tartalmazó reakcióelegyből. Ezután azonnal fagyasztva szárítjuk az ecetsavas oldatot, a műveletet sötétben végezzük. Az így kapott fehér színű szilárd halmazállapotú terméket 10 ml 0,2 mólos gázmentes ecetsav és 4 ml jégecet elegyében szuszpendáljuk. A szuszpenziót melegítjük, azonban a szilárd halmazállapotú anyag teljesen nem oldódik fel. Szűréssel eltávolítjuk az oldhatatlan anyagot, az opaleszkáló, színtelen szürletet Sephadex G-25 F gyantából készült oszlopra öntjük. A kromatográfiát 0,2 mólos gázmentes ecetsavval végezzük, az oszlop 7,5x150 cm méretű, a kromatográfiát 26 °C hőmérsékleten végezzük, az átfolyási sebesség 629 ml/óra. 22,0 ml térfogatú frakciókat különítünk el. A frakciók elnyelését 280 m/r hullámhosszúságú fényben vizsgáljuk. A vizsgálatok szerint egy nagy elnyelési maximum látszik, a maximum után váll figyelhető meg. Az ultraibolya abszorpciós spektroszkópia szerint a fő maximumot mutató frakció tartalmazza a terméket. Egyesítjük a megfelelő frakciókat, amelyek térfogata a következő: 224-240. frakció, 4906-5280 ml, elnyelési maximum: 5054 ml. Ezek -a frakciók nem tartalmazzák az elnyelési maximumot követő vállat. Az ultraibolya abszorpciós spektroszkópia szerint 175 mg terméket kaptunk, ez megfelel 24,8%-os kitermelésnek. Egy aliquot minta Ellman-titrálása szerint a termék szulfhidril-tartalma az elméletinek 93,6%-a. 4. példa A D-Val1-szomatosztatin oxidációval való előállítása A 3. példában megadottak szerint előállított redukált D-Val1 -szomatosztatin 374 ml térfogatú, elméletileg 175 mg anyagot tartalmazó oldatát 147 ml 0,2 mólos ecetsavval és 2967 ml desztillált vízzel hígítjuk, ami után 50 ug/ml koncentrációjú oldatot kapunk. Tömény ammóniumhidroxiddal 6,7-re állítjuk be az elegy pH-ját. Sötétben és szobahőmérsékleten 64 órán át keverjük a reakcióelegyet, ami után az Ellman-titrálás szerint az oxidáció teljes. Csökkentett nyomáson kivitelezett desztillációval 10 ml térfogatra töményítjük az oldatot. A sűrítményt 10 ml jégecettel hígítjuk, majd Sephadex G—25 F gyantából készült oszlopon kromatografálva sómentesítjük. A kromatográfiát 50%-os gázmentes ecetsavval, 5,0 x 90 cm méretű oszlopon, 26 °C hőmérsékleten, 246 ml/óra átfolyási sebességgel végezzük, és 16,4 ml térfogatú frakciókat különítünk el. 280 m/L( hullámhosszon vizsgáljuk a frakciók fényelnyelését, amikor két kiemelkedő elnyelési maximumot figyelhetünk meg. Az első maximum a termék aggregált alakjait reprezentálja, a második maximum a monomer termék jelenlétére utal. A második elnyelési maximumot mutató 49—64. frakciókat (787-1050 ml) összegyűjtjük, és sötétben fagyasztva szárítjuk. A kapott szilárd halmazállapotú terméket 15 ml 0,2 mólos gázmentes ecetsavban oldjuk, az »oldatot Senhadex G-25 F gyantából készült oszlopra öntjük, a kromaíogiáfiát 0,2 mólos gázmentes ecetsavval, 5,0 x 150 cm méretű kromatografáló oszlopon, 26 °C hőmérsékleten, 5 10 15 20 2'5 30 35 40 45 50 55 60 65 4
