177435. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatosztatin analógok előállítására
9 177435 10 475 nd/óra átfolyási sebességgel végezzük, és 16,6 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A frakciók elnyelési maximupiát 280 mp hullámhosszúságú fényben vizsgáljuk. A vizsgálatok egy nagy elnyelési maximumot jeleznek. Az ultraibolya abszorpciós spektroszkópia szerint az elnyelési maximumot mutató frakciók nagy része a terméket tartalmazza. A 157—172., 2590—2855 ml térfogatú (elnyelési maximum: 2667 ml) frakciókat egyesítjük, és sötétben fagyasztva szárítjuk. Az ultraibolya abszorpciós spektroszkópia szerint 95 mg előállítani kívánt terméket kaptunk, a redukált alakra számítva ez 54,3%-os kitermelésnek felel meg. Az előállított szilárd halmazállapotú termék egy részét 5 ml 50%-os ecetsavban oldjuk, és Sephadex G—25 F gyantából készült oszlopon újra kromatografáijuk. A kromatográfiát 50%-os gázmentes ecetsavval, 2,5 x 180 cm méretű oszlopon, 26 °C hőmérsékleten, 53,2 ml/óra átfolyási sebességgel végezzük, és 8,87 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az egyes frakciók fényelnyelését 280 mp hullámhosszúságú fényben vizsgáljuk, egy nagy elnyelési maximum figyelhető meg. Az ultraibolya abszorpciós spektroszkópia szerint az elnyelési maximumot mutató frakciók tartalmazzák a terméket. Az 56—60. sorszámú, 488—532 ml térfogatú frakciókat (elnyelési maximum: 505 ml) egyesítjük, és sötétben fagyasztva szárítjuk. A termék 1%-os ecetsav oldatban vizsgálat optikai forgatása [a]^6 :—42,1°. Amino sav-analízis : valin: 0,98, glicin: 1,01, 2cisztein: 1,81, 21izin: 1,99, aszparagin: 0,95, 3 fenilalanin: 2,94, triptofán: 0,80, 2treonin: 1,91 és szerint: 0,85. A fenti eredményeket (glicin + lizin) per 3 arányban kifejezve: 1,0. 21 órán át a következő három hidrolízist végezzük: 1. a ciszteint dszteinsawá oxidálására dimetilszulfoxid jelenlétében, 2. tioglikolsav tisztítás és 3. tisztítás vagy oxidálás nélkül. Az összes fenti eredmény a három hidrolízis átlagos eredményeit jelentik, kivéve a következők: cisztein és szerin: az 1. és 3. hidrolízisből, triptofán: a 2. hidrolízisből, fenilalanin: a 2. és 3. hidrolízisből. A gyomorsav kiválasztás gátlásának in vivo vizsgálatára a D-Val1-szomatosztatin hatását kutyákban vizsgáljuk. 6 kutyába krónikus físztulát vezetünk, és Heidenhain-zsákkal látjuk el őket, a gasztrikus sósav szekréciót a gasztrin C-terminális tetrapeptidjének infúziójával indukáljuk, az adagolás sebessége óránként és testsúlykilogrammonként 0,5 pg. Mindegyik kutya önmaga kontrollja, oly módon, hogy egy más napon csak a tetrapeptidet adagoljuk nekik. Egy másik napon a 6 kutya tetrapeptidet és egy órás hidrogénklorid szekréciót követően D-Val1 -szomatosztatint kap infúzióval, egy órán keresztül, óránként és testsúlykilogrannnonként i 0,75 pg mennyiségben. A gyomorsav mintákat további 1,5 órán át, 15 perces időközönként összegyűjtjük. A gyomorsav-tartalmat pH 7-re való automatikus titrálássai határozzuk meg. A D-Val1 - 5 -szomatosztatin maximális gátló hatását a szomatosztatin dózis-hatás görbéjének segítségével extrapolálással határozzuk meg, és a szomatosztatin analóg relatív gátló hatását %-os aktivitásban adjuk meg. A D-Val1-szomatosztatin a gasztrin C-terminá- 10 lis tetrapeptidje által indukált állandó gyomorsav szekrécióját 85,1%-osan (± 6,0% standard hiba) gátolja. Ez a hatás megfelel 0,935 pg/kg/óra szomatosztatin hatásának. A D-Val1-szomatosztatin aktivitása 125%-os a szomatosztatinéhoz képest. 15 A találmány szerinti D-Val1 -szomatosztatin hatását megvizsgáltuk éber kutyák bélmozgására is. 3 kutya antrumába, duodenumába és piloruszába intralumenális katétereket helyeztünk. A béltérben levő nyomás változását Visicorder készülékkel 20 mértük, mérőelemeket és miniatűr fénysugár galvanométereket használva. Ami után megállapítottuk az állandó kontrollt, intravénás infúzióval 10 percen át D-Val1-szomatosztatint adagoltunk. A vegyület kezdetben növelte az intralumenális nyo- 25 mást a piloruszban, majd csökkentette, a duodenumban és antrumban a nyomás az egész vizsgálat során csökkent. A püorikus nyomás növelésére és a duodenumban, továbbá az antrumban levő nyomás csökkentésére szükséges legkisebb hatásos dózis ki- 30 sebb, mint 0,125 pg/testsúlykilogramm, 10 perces adagolást számítva. A szomatosztatin esetén ez 0,125-0,25 pg/kg, 10 perces adagolással. A találmány szerinti eljárással előállított D-Val1-szomatosztatin gátolja a hasnyálmirigy szek- 35 récióját is. 3, mind hasnyálmirigy és teljes gasztrikus fisztulával rendelkező kutyában 2 egység/kg/óra szekretin és 0,45 egység/kg/óra koledsztokinin infúzióval való adagolásával indukáltuk a hasnyálmirigy szekrécióját, indukáltuk továbbá a 40 gyomorsav szekrécióját 0,5 mg/kg/óra mennyiségű tetragasztrin infúzióval. Ami után beállt az állandó állapot, mindegyik kutyának egy órán át 0,75 pg/kg/óra D-Val1 -szomatosztatint adagoltunk. A kontrolihoz képest legnagyobb %-os gátló hatás 45 a teljes fehérjetartalmat vizsgálva -51% volt. Vizsgáltuk a D-Val1 -szomatosztatin hatását a növekedési hormon felszabadulására is. A vizsgálatot közönséges, 100-120 g súlyú hím Sprague-Dawley patkányokkal (Laboratory Supply Con> >0 pany, Indianapolis, Indiana) végeztük. A vizsgálat a Brazeau, Vale és Guilleman [(Edocrinology, 94, 184, (1974)] módszerének módosítása szerint történt. A vizsgálat során 5 csoportba 8-8 patkányt osztottunk, A növekedési hormon szekréciói5 jának stimulálására mindegyik állatnak intraperitoneálisan nátrium-pentabarbitált adagoltunk. Egy csoport csak sóoldatot kapott, ez a kontrollcsoport. Két csoportnak szomatosztatint adagoltunk, az egyiknek szubkután 2 pg/patkány mennyiségben, ;o a másiknak szintén szubkután 50 pg/paktány mennyiségben. A másik két csoport D-Val1-szomatosztatint kapott az egyik 2 pg/patkány, a másik 50 pg/patkány mennyiségben, szubkután. A növekedési hormon szérumkoncentrációját a nátrium- 15 -pentabarbitál és a vizsgált vegyület szimultán ada-5
