177391. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maytazinol és származékai előállítására
13 177391 Egy élesztő extraktum — maláta extraktum táptalajon növesztett, maytanzinolt, maytanacint és maytanzinol-propionátot termelő, C—15003 számú Nocardia mikroorganizmust (IFO 13726, FERM 3992, ATCC 31281) egy 40 térfogatrész beoltó táptalajt tartalmazó 200 térfogatrész méretű fermentor beoltására használunk fel. A beoltó táptalaj összetétele: 2% glükóz, 3% oldható keményítő, 1% nyers szójabab liszt, 1% kukoricacsávázó folyadék, 0,5% polipepton, 0,3% nátrium-klorid, 0,5% kalcium-karbonát, (pH 7,0). A beoltott táptalajt 28 °C-on inkubáljuk 48 órán át inokulum előállítása céljából. Az így kapott inokulum 0,5 térfogatrésznyi mennyiségét egy 200 térfogatrész méretű, 40 térfogatrész táptalajt tartalmazó fermentorba adagoljuk. A táptalaj összetétele a következő: 5% dextrin, 3% kukorica csávázó folyadék, 0,1% polipepton, 0,5% kalcium-karbonát, pH 7,0. .A táptalajon 28 °C-on 90 órán át tenyésztést végzünk egy inokulum előállítása céljából (oltó tenyészet). Sorozat hígítási technikával meghatározva, vizsgálati mikroorganizmusként Tetrahymena pyriformis W-t és összehasonlítóként C-15003 P-3 antibiotikumot használva a fenti tenyészet titer értéke 25 üg/ml-nek adódik. 1. példa 2. példa 10 térfogatrész az 1. példában kapott inokulumot egy 2000 térfogatrész méretű, 500 térfogatrész oltó tenyészet táptalajt tartalmazó fermentorba viszünk (a táptalaj az 1. példában megadottal azonos) és 48 órán át 28 °C-on inkubálást végzünk. A kapott tenyészet 500 térfogatrésznyi mennyiségét egy 50 000 térfogatrész méretű, rozsdamentes acélból készült tartályba visszük, amely 30 000 térfogatrész oltó tenyészet közeget tartalmaz és a tenyésztést 28 °C-on, levegőztetés mellett (280 fordulat/perc 1/2 DT/) és 1 kg/cm2 belső nyomás alatt végezzük. A kapott oltó tenyészetet 200 000 térfogatrész méretű, rozsdamentes acélból készült, 100 000 térfogatrész az 1. példában használthoz hasonló táptalajt tartalmazó fermentorba adjuk 10% inokulációs sebesség mellett. A beoltott táptalajt 28 °C-on inkubáljuk, levegőztetés (100 000 térfogatrész/perc), keverés (200 fordulat/perc), és 1 kg/cm2 belső nyomás mellett, 90 órán át. Az 1. példában leírt módszer meghatározva a kapott tenyészet titere 25 pg/ml. A kapott 95 000 térfogatrész tenyészethez 2000 súlyrész Hyflo-supercel ®-t (Johnes and Manville Products, USA) adunk és alapos keverés után, az elegyet nyomószűrőn szűrjük. 85 000 térfogatrész szűrletet és 32 000 súlyrész nedves sejtet kapunk. A 85 000 térfogatrész szűrletet keverjük és 30 000 térfogatrész etilacetáttal extraháljuk. Az eljárást még egyszer megismételjük. Az etilacetátos rétegeket összegyűjtjük, kétszer 30 000 térfogatrész vízzel mossuk, 500 súlyrész vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk, és csökkentett nyomáson 200 térfogatrész mennyisére koncentráljuk. A koncentrátumhoz petrolétert adunk és a kapott csapadékot (53 súlyrész) szűréssel elkülönítjük. Ezt az I. számú nyersterméket elkeverjük 100 térfogátrész etilacetáttal és az oldhatatlan részeket kiszűrjük. A szűrletet 10 súlyrész szilikagéllel keverjük el (Merck, NSZK, 0,05 -0,2 mm) és az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy 400 térfogatrész méretű szilikagél oszlop tetejére. Az eluálást 500 térfogatrész hexánnal, 500 térfogatrész 3 : 1 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész 1 : 1 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész 1 : 3 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész etilacetáttal és 1000 térfogatrész 50:1 arányú etilacetát-metanol eleggyel végezzük, az eluátumokat 100 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtve össze. Minden frakció 1 térfogatrésznyi mennyiségét szárazra pároljuk és 0,1 térfogatrész etilacetátot adunk a koncentrátumhoz. A kapott elegyet egy szilikagél-üveglap (Merck, NSZK, 60F254 , 0,25 mm, 20x20) alsó sarkától számítva 2,5 cm-re cseppentjük és egy 19 :1 arányú etilacetát-metanol oldószer rendszerrel futtatva körülbelül 17 cm-re hívjuk elő. Előhívás után a detektálást ultraibolya fénnyel végezzük (hullámhossz: 2537 Â). A 0,58-0,63 Rf-értékü 25-30 frakciókat és a 0,25-0,30 Rf-értékű 38-40 frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson körülbelül 20 térfogatrészre koncentráljuk. A kapott koncentrátumokhoz 150-150 térfogatrész petrolétert adunk, és így 5 súlyrész II. számú nyersterméket és 2 súlyrész nyers maytanzinolt kapunk. 10 térfogatrész etilacetátban feloldjuk a fenti II. számú nyerstermék 1,5 súlyrésznyi mennyiségét. majd az oldatot jól elkeverjük 4 súlyrész szilikagéllel (Merck, NSZK, 0,05—0,2 mm). Az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy 300 térfogatrészes szilikagél oszlop tetejére, és az oszlopot először 500 térfogatrész kloroformmal mossuk, majd 500 térfogatrész 20 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel és 10 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. Az eluátumokat 25 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtjük. Mindegyik frakció 0,5 térfogatrésznyi mennyiségét csökkentett nyomáson koncentráljuk. A kapott koncentrátumhoz 0,05 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyből vett mintát szilikagél vékonyrétegkromatográfiás eljárással vizsgáljuk (előhívó rendszer: 9 :1 arányú kloroform-metanol elegy). Az Rf 0,48—0,50 zónában 2537 A-nél abszorbeáló 40 és 41 számú frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékhoz 0,5 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ily módon 0,05 súlyrész vegyes maytanacin, maytanzinol-propionát kristályt állítva elő. A maytanacin és maytanzinol-propionát így kapott elegykristályainak 0,05 súlyrésznyi mennyiségét feloldjuk 5 térfogatrész metanolban, majd 0,1 súlyrész nátriumkloridot és 5 térfogatrész vizet ' 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
