177391. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maytazinol és származékai előállítására
15 177391 16 adunk az oldathoz. Egy oszlopot megtöltünk 200 térfogatrész Diaion HP— 10-el (Mitsubishi Kaséi K. K.) és 600 térfogatrész 50%-os, 5% nátriumkloridot tartalmazó metanol-víz eleggyel mossuk. A fenti oldatból vett mintát átengedjük az oszlopon, 5 és gradiens technikával eluáljuk, 1500 térfogatrész 60%-os metanol-víz elegyet (amely 5% nátriumkloridot tartalmaz) 1500 térfogatrész 95%-os metanol-víz elegyet használva. 10 Az eluátumot 15 térfogatrésznyi frankciókban fogjuk fel és valamennyi frakciót megvizsgáljuk vékony rétegkromatográfiásan. A 13Ö—135 frakciók tartalmazzák a maytanacint és a 138-142 frakciók a maytanzinol-propionátot. 15 Valamennyi frakciót betöményítjük és 30 ml víz és 50 ml etilacetát hozzáadásával feloldjuk. Az oldatot elválasztó tölcsérben rázzuk és a vizes réteget elválasztjuk és miután kétszer 30 ml vízzel átmos- 20 tűk, az etilacetátos réteget vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk, koncentráljuk és állni hagyjuk. A fenti eljárással valamennyi frakcióból kristályokat kapunk. A kristályokat szűréssel összegyűjtjük és szárítjuk. A maytanacin mennyisége: 0,013 g, 25 míg a maytanzinol-propionát mennyisége: 0,013 g. 3 térfogatrész etilacetátban feloldunk 0,2 súlyrész nyers maytanzinolt, melyet a fenti lépésben kaptunk, és az oldatot jól elkeveijük 30 0,5 súlyrész szilikagéllel (Merck, NSZK, 0,05-0,2 mm). Az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy 80 térfogatrész szilikagélből álló oszlop tetejére és az oszlopot először 150 térfogatrész kloroformmal 35 mossuk, majd 150 térfogatrész 50 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel és 150 térfogatrész 20:1 arányú kloroform-metanol eleggyel, végül 300 térfogatrész 10 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. Az eluátumot 10 térfogatrésznyi frakciók- 40 ban gyűjtjük össze. Az egyes frakciók 0,5—0,5 térfogatrésznyi mennyiségét csökkentett nyomáson koncentráljuk. A koncentrátumhoz 0,05 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet mintaként vékonyrétegkroma- 45 tográfiásan vizsgáljuk, előhívó rendszerként kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyét használva. A 2537 Á-nél abszorbeáló 50—52 frakciókat (Rf = 0,33—0,38) összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékhoz 0,5 tér- 50 fogatrész etilacetátot adunk és az elegyet állni hagyjuk. 0,020 súlyrész maytanzinol kristályt kapunk. 32 000 súlyrész a 2. példában kapott sejtet 50 000 térfogatrész 70%-os aceton-víz eleggyel, keverés közben 3 órán át extrahálunk, majd nyomó- 60 szűrőn szűrünk. Az extrahálást 50 000 térfogatrész 70%-os aceton-víz eleggyel még egyszer megismételjük. A szűrleteket összegyűjtjük és az acetont csökkentett nyomáson végzett koncentrálással eltávolítjuk. A kapott vizes rendszert átvezetjük egy 65 5000 térfogatrész Diaion HP-10-et (Mitsubishi Kaséi K. K.) tartalmazó oszlopon. Az oszlopot 20 000 térfogatrész vízzel és 50%-os metanollal mossuk, majd 15 000 térfogatrész 90%-os metanolvíz eleggyel eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson koncentráljuk 3000 térfogatrészre és kirázzuk 3000 térfogatrész vízzel és 3000 térfogatrész etilacetáttal. A fenti eljárást még egyszer megismételjük. Az etilacetátos réteget egyesítjük, vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk és csökkentett nyomáson 200 térfogatrészre koncentráljuk. A koncentrátumhoz petrolétert adunk és a kapott csapadékot (280 súlyrész) szűréssel elkülönítjük. A fent kapott I. számú nyersterméket szilikagél oszlopon végzett kromatografálással tisztítjuk az 1. példához hasonló módon. 1,0 súlyrész nyers II. számú terméket és 0,5 súlyrész nyers maytanzinolt kapunk. 4. példa 1000 térfogatrész a 2. példában kapott tenyészetet egy rozsdamentes acélból készült, 200 000 térfogatrész űrtartalmú tartályba oltunk, amely 100 000 térfogatrész oltó kultúra táptalajt tartalmaz, és a beoltott táptalajt 28 °C-on, levegőztetés (100 000 térfogatrész/perc) és keverés (200 fordulat/perc) mellett 48 órán át inkubáljuk az oltókultúra előállítása céljából. Ezt az oltókultúrát átvisszük egy rozsdamentes acélból készült, 200 000 térfogatrész méretű tartályba, mely 100 000 térfogatrész az 1. példában leírttal megegyező táptalajt tartalmaz. Az átviteli arány 10%. A tenyésztést 28 °C-on levegőztetés (1 000 000 térfogatrész/min), keverés (120 ford/min) és belső nyomás (1 kg/cm2) mellett 90 órán át végezzük. A kapott tenyészet titerét 20üg/ml-nek találtuk az 1. példában ismertetett eljárással végezve a kiértékelést. A fenti tenyészet 900 000 térfogatrésznyi mennyiségéhez 900 000 térfogatrész acetont adunk és egy órás keverés után 20 000 súlyrész Hyflo-Supercel-t (Johnes and Man ville, USA). Az elegyet tovább keverjük és nyomószűró'n szűrjük. A kapott szűrletet 170 000 térfogatrésznyi mennyiségéhez 500 000 térfogatrész vizet adunk, és az elegyet egy Podbielniak-ban (Podbielniak, Inc. USA) az elegyet 1 000 000 térfogatrész etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos réteget vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk és csökkentett nyomáson koncentráljuk A koncentrátumhoz petrolétert adunk és a kapott precipitátumot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk. A fenti eljárással 680 súlyrész I. számú nyersterméket kapunk. Ezután, mint a 2. és 3. példákban, ezt a nyersterméket tisztítjuk, amikor 1,1 súlyrész maytanacint, 2,2 súlyrész maytanzinol-propionátot és 0,1 súlyrész maytanzinolt kapunk. Szabadalmi igénypont: Eljárás maytanzinol, maytanacin és maytanzinol-propionát előállítására, azzal jellemezve, hogy egy Nocardia C-15003 jelzésű, ATCC 31281 szám alatt letétbe helyezett mikroorganizmust asszimilál-8
