177391. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maytazinol és származékai előállítására
7 177391 8 kiadás 1974” című kiadványával és más irodalmi adatokkal. Miután a törzset a Nocardia genus III. csoportjába tartozónak véltük, az a tény, hogy az ismert törzsek között nem találtunk olyat, amelynek a tulajdonságai azonosak lettek volna, arra a következtetésre kellett jutnunk, hogy az általunk vizsgált törzs egy új speciest képvisel. A C-15003 számú törzset 3992 szám alatt letétbe helyeztük a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology mikroorganizmus gyűjteményében (FERM), míg a törzs a The Institute for Fermentation, Osaka (IFO) gyűjteményében az IFO 13726 számot és a The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, USA gyűjteményében a 31281 számot kapta. Míg a C—15003 számú törzs a Nocardia genus egy új species-e, mint említettük, a többi mikroorganizmushoz hasonlóan hajlamos különböző változatok és mutánsok kialakítására akár spontán módon, akár mutagének hatására. így például a törzs sok variánsát kaphatjuk röntgensugarakkal végzett besugárzás hatására vagy gamma-sugarak, ultraibolya sugarak hatására, egysejtes izolálással, különböző vegyszereket tartalmazó táptalajokban végzett tenyésztéssel vagy bármely egyéb mutagén kezeléssel. A törzsből spontán módon keletkezett mutánsokat ugyancsak nem tekintjük külön species-nek, ellenkezőleg, bármely ilyen változat vagy mutáns, amely alkalmas a maytanzinol, maytanacin és maytanzinol-propionát termelésére, felhasználható a találmány céljaira. így például a C-15003 törzset különféle mutagén kezeléseknek alávetve olyan mutánsokat kapunk, amelyeknél lényegében hiányzik az oldható pigment termelő képesség, amelyekben a micéliumok színtelenek, sárgászöldek, vöröses cserszínűek vagy narancsvörösek, más mutánsok gombasejtjei bacillusszerű elemekre vagy elágazó, rövid sejtekre képesek felhasadni, ismét mások kevés fehér légmicéliumot tartalmaznak vagy lényegében légmicélium nélküliek. A maytanzinol, maytanacin vagy maytanzinol-propionát termelésére alkalmas törzstenyésztésre (a törzset a továbbiakban néha „termelőképes” törzsként rövidítjük) szolgáló táptalaj lehet folyékony vagy szilárd táptalaj, ha olyan tápanyagokat tartalmaz, amelyeket a törzs hasznosítani tud, bár nagyüzemi gyártáshoz előnyös folyékony táptalaj használata. Az ilyen, C—15003 antibiotikumot ' termelő törzsek tenyésztésére felhasznált táptalaj bármely cseppfolyós vagy szilárd táptalaj lehet, azzal a feltétellel, hogy olyan tápanyagokat tartalmaz, amelyeket a törzs hasznosítani képes, bár nagyüzemi termelés esetében a folyékony táptalajok használata kedvezőbb. A táptalajok tartalmazhatnak nitrogén- és szén forrásokat, amelyeket a C—15003 számú mikroorganizmus képes asszimilálni és emészteni, szervetlen anyagokat, nyomnyi mennyiségű tápsókat és egyéb anyagokat. Szénforrásként például a következő anyagokat használhatjuk: glükóz, laktóz, szacharóz, maltóz, dextrin, keményítő, glicerol, mannitol, szorbitol, zsírok és olajok (például szójabab olaj, disznózsír, csirkezsír). Nitrogén forrásként például a következő vegyületeket használhatjuk: hús extraktum, élesztő extraktum, szárított élesztő, szójabab liszt, kukoricacsávázó folyadék, pepton, lenmag liszt, maláta hulladék, karbamid, ammóniumsók (például ammóniumszulfát, ammóniumklorid, ammóniumnitrát, ammóniumacetát). A táptalaj ezen felül tartalmazhat nátrium-, kálium-, kalcium-, magnézium- és egyéb sókat, így vas-, mangán-, cink-, kobalt-, nikkelsókat, foszforsav-, bórsav-sókat és szerves savak sóit, így acetátokat és propionátokat. A táptalaj ezenkívül tartalmazhat még különféle aminosavakat (például glutaminsav, alanin, glicht, lizin, metionin, prolin), peptideket (például dipeptidek, tripeptidek), vitaminokat (például B!, B2 vitaminok, nikotinsav, B, 2, C és E vitaminok), nukleinsavakat (például purin, pirimidin és származékaik). A táptalaj pH-értékének beállítása céljából egy szervetlen vagy szerves savat, lúgot, puffereket és hasonló anyagokat adhatunk a rendszerhez. Habzásgátlóként olajok, zsírok, felületaktív szerek és más megfelelő anyagok alkalmas mennyiségeit használhatjuk. A tenyésztést bármely stacioner, rázó, merülő aerob és más módszerrel végezhetjük. Nagyüzemi termelésre természetesen a merülő aerob tenyészetek a legalkalmasabbak. Míg a tenyésztés körülményei természetesen függnek a táptalaj összetételétől, a törzstől, az alkalmazott módszertől és más tényezőktől, az inkubálást 20 és 35 °C között, megközelítőleg 7,0 kezdeti pH-érték mellett végezzük. Különösen kívánatos, hogy a hőmérséklet 23 és 30 °C között legyen a tenyésztés közbenső szakaszában és a kezdeti pH-érték 6,5 és 7,5 között változzon. Bár az inkubálás ideje szintén a fenti tényezők függvénye, tanácsos az inkubálást addig végezni, míg a kívánt antibiotikum titer-értéke maximális nem lesz. Rázó kultúrák vagy aerob merülő tenyészetek esetében ez az idő általában 48—144 óra között van. Az antibiotikum potenciálját Tetrahymena pyriformis W-al viszgáltuk. így a fenti mikroorganizmust egy vizsgálati táptalajon (20 g proteóz-pepton(Difco), 1 g élesztő extraktum(Difco), 2 g glükóz, 1000 ml desztillált víz és 10 ml 1 mólos foszfát puffer (pH 7) 28 °C-on, 44—48 órán át tenyésztettük és az antibiotikum potenciálját sorozat hígításos módszerrel határoztuk meg, nyomon követve a zavarosodás változását, megvizsgáltuk a hasvízkór daganatsejtjeire kifejtett hatást és a későbbiekben leírt módon vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat végeztünk. A maytanacint, maytanzinolt vagy maytanzinol-propionátot a kapott táptalajon termeljük és gyűjtjük össze, extra- és intracellulárisan egyaránt. Az anyagok egyike sem mutat antibiotikus hatást, így a Tetrahymena törzzsel szembeni aktivitással párhuzamosan vékonyrétegkromatográfiás módszerrel kerültek detektálásra. így a fermentlét sejtekre és szűrletre különítettük el szűréssel vagy centrifugálással és a szűrletet azonos mennyiségű etilacetáttal extraháltuk. A sejtekhez ugyanolyan mennyiségű 70%-os aceton-víz elegyet adunk, mint a szűrlethez és egy órás, 20 °C-on végzett keverés után a szuszpenziót szűrtük. Az acetont eltávolítottuk a szűrletből és a kapott vizes szűrletet etilacetáttal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
