177391. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maytazinol és származékai előállítására
9 177391 10 extraháljuk. Valamennyi extraktumot 1/100 térfogatra koncentráltunk és vékonyrétegkromatográfiás méréssel vizsgáltunk, szilikagél lemezen (Merck, NSZK, Kieselgel 60 F 254, 0,25 mm, 20 x 20). Oldószer rendszerként kloroform és metanol 9 :1 arányú elegyét használtuk. A potenciált a foltok intenzitásának alapján határoztuk meg, amit 2537 Á-nél ultraibolya fénnyel végzett besugárzással határoztuk meg. A táptalajon így előállított maytanacin, maytanzinol-propionát vagy maytanzinol lipofii és semleges anyagok, és könnyen kinyerhetők általánosan használt elkülönítési és tisztítási eljárásokkal, amelyeket rendszerint ilyen típusú szervezetek begyűjtésére alkalmazunk. Így például használhatjuk azt az eljárást, amely az antibiotikumok és a szennyezések oldhatóságában mutatkozó különbséget hasznosítja, azaz, amely a különféle adszorbensekkel szemben mutatott adszorptív affinitást hasznosítja (ilyen adszorbensek lehetnek például: aktív szén, makropórusos, nem-ionos gyanták, szilikagél, alumíniumoxid). A szennyezések ezen kívül ioncserélő gyantákkal és más módszerekkel is eltávolíthatók, amelyeket egymagukban vagy alkalmas kombinációban, adott esetben ismételten is alkalmazunk. Miután az említett vegyületek a szürletben és a sejtekben egyaránt előfordulnak, az antibiotikumok elkülönítése és tisztítása ilyen adszorbensek segítségével, ha használatukra egyáltalán sor kerül, történhet akár közvetlenül, akár — szűrlet esetében — oldószeres extrákció, vagy — mikrobiológiai sejtek esetében - oldószeres extrakció után. Az oldószeres extrakciót a következő módszerek bármelyike szerint végrehajthatjuk: (1) A fermentlé oldószeres extrakciója a sejtek elkülönítése előtt, (2) a sejtek és a szűréssel, centrifugálással vagy más módszerekkel kapott szűrlet oldószeres extrakciója. A szűrlet és a sejtek független extrakciójára előnyösen a következő eljárást használjuk. A szűrlet extrakciójára alkalmas oldószerek vízzel nem elegyedő, szerves oldószerek, így zsírsav-észterek, például etilacetát, amilacetát, alkoholok, például butanol, halogénezett szénhidrogének, például kloroform és ketonok, például metil-izobutil-keton. Az extrakciót semlegeshez közeli pH-értéken hajtjuk végre és előnyösen, az előzőleg pH 7-re beállított folyékony fermentlét etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumot vízzel mossuk és csökkentett nyomáson koncentráljuk. Ezután egy nem poláros oldószert, így petrolétert vagy hexánt adunk a koncentrátumhoz és a hatóanyagot tartalmazó I számú nyersterméket kinyerjük. Mivel vékonyrétegkromatográfiás mérések szerint a maytanacin, maytanzinol-propionát és maytanzinol mellett számos más foltot is kapunk, az I. számú terméket több lépcsőben a következő tisztítási eljárásokkal dolgozzuk fel. így szokásos tisztítási eljárásként adszorpdós kromatográfiát használhatunk erre a célra, adszorbensként a szokásos adszorbensek valamelyikét, így szilikagélt, alumíniumoxidot, makropórusos nem-ionos adszorbens gyantát alkalmazhatunk. Az I. számú nyerstermék tisztítására legelőnyösebb a szilikagél használata. Az előhívást például úgy hajthatjuk végre, hogy petroléterrel és hexánnal indulunk és az eluálast valamely poláris oldószerrel, úgy mint etilacetáttal, acetonnal, etanollal vagy metanollal végezzük. Egy szokásos eljárás szerint, vivőanyagként szilikagélt használva (Merck, NSZK, 0,05-0,2 mm), az oszlopkromatográfiát úgy végezzük, hogy a hexán : etilacetát arányt fokozatosan növeljük. Az eluátumból mintát veszünk, amelyet vékonyrétegkromatográfiásan vizsgálunk meg és a hatóanyagokat tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson koncentráljuk. Ezután a koncentrátumhoz petrolétert vagy hexánt adunk, miáltal II. számú nyersterméket kapunk. Mivel ez a termék még tartalmaz szennyezéseket, a következőképpen tovább tisztítjuk. A II. számú nyersterméket például szilikagél oszlopon tisztíthatjuk, különféle oldószerrendszereket használva. Az erre a célra használt előhívórendszer egy halogénezett szénhidrogénből, így diklórmetánból vagy kloroformból állhat, egy poláris oldószer, úgy mint alkohol, például metanol vagy etanol, keton, például aceton vagy metiletilketon vagy más hasonló oldószerek hozzáadása mellett. Ezzel a módszerrel elkülönítjük a maytanacint, maytanzinol-propionátot és maytanzinolt. Az első és második szilikagél oszlopra felvitt oldószerek sorrendje megfordítható, és szükség esetén a fenti rendszerekkel együtt még más szokásos szerves oldószerek is használhatók. Ha makropórusos adszorbens gyantát használunk a tisztítás eszközéül a II. számú nyerstermék tisztítása során, a maytanacin, maytanzinol-propionát és maytanzinol eluálását víz és egy rövidszénláncú alkohol, rövidszénláncú keton vagy észter elegy ével végezzük. A rövidszénláncú alkohol lehet például metanol, etanol, propanol vagy butanol és a rövidszénláncú keton lehet például aceton vagy metiletilketon. Észterként például etilacetátot használhatunk. Egy tipikus eljárás szerint a II. számú nyersterméket feloldjuk egy 60%-os metanol-víz elegyben és egy Diaion HP—10 (Mitsubishi Kaséi K. K.) oszlopon adszorbeáljuk. Az oszlopot egy 70%-os metanol-víz eleggyel mossuk, majd az eluálást 90%-os metanol-víz eleggyel hajtjuk végre. Ezzel az eljárással a maytanacint, maytanzinol-propionátot vagy maytanzinolt eluáljuk az oszlopról. Bármelyik fent leírt eljárásban az aktív vegyületeket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson koncentráljuk. A száraz termékhez 5—8 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet állni hagyjuk, majd elkülönítjük a maytanacint, maytanzinol-propionátot vagy maytanzinolt. Ezeket a vegyületeket ezután egy adszorbens segítségével választjuk el egymástól. Erre a célra bármelyik eddig említett adszorbens használható. így szilikagélt vagy makropórusos, nem-ionos adszorbens gyantát használva és a fenti oldószerekkel dolgozva a kívánt vegyületek frakcionálisan eluálhatók. Ha például szilikagélt használunk, az előhívást hexánnal, etilacetáttal vagy kloroform-metanol eleggyel hajtjuk végre, a maytanzinol-propionát és maytanacin az itt megadott sorrendben jelennek meg. Vékonyrétegkromatográfiás detektálás az egyes frakciókat külön-külön koncentráljuk csök-S 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
