177132. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH hatású terc-butilezett triptfént tartalmazó peptidek előállítására
13 177132 14 A kiindulási anyagként alkalmazott pepiidet az alábbi módon állíthatjuk elő. H—Trp(2’,5 ’,7 ’-tri-tBu)-OH 20 g (98 mmól) H-Trp-OH-t 100 ml (1,05 mól) terc-butanol és 300 ml trifluorecetsav elegyében oldunk és az oldatot szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 20 óra múlva bepároljuk. Az olajos maradékot a visszamaradt trifluorecetsav eltávolítására vízzel összerázzuk. A savanyú oldat leöntése után a sűrű maradékhoz ismét vizet adunk és annyi nátriumhidrogénkarbonátot, hogy a kioldódó trifluorecetsavat éppen semlegesítse. A termék ekkor kristályossá válik. Leszűqük és 50%-os etanolból átkristályosítjuk. 12,6 g (34,5%) H—Trp(2’,5’,7’—tri— —tBu)—OH-t kapunk. Op.: 221-223 °C, R? =0,47. Elemzés a C2 3 H3 6N2 02 összegképlet alapján: számított: C =74,15%, H =9,74%, N = 7,52%, talált: C =73,92%, H =9,81%, N = 7,44% BOC —Trp(2 ’,5 ’,7 ’-tri-tBu)-OH 10,0 g (26,9 mmól) H-Trp(2,,5,,7’-tri-tBu)-OH-t 20 ml díoxán, 20 ml víz és 7 ml 4 n nátriumhidroxid elegyében oldunk. 5 g (35 mmól) terc-butiloxikarbonilazidot adunk a reakcióelegyhez és szobahőmérsékleten keverjük, közben a pH-t 4 n nátriumhidroxid adagolásával 9,5 és 10 között tartjuk. 5 óra múlva a terc-butiloxikarbonilazid fölöslegét éterrel kirázzuk, a vizes oldathoz újra étert öntünk és keverés közben tömény sósavval óvatosan pH 3-ra savanyítjuk. Szárítás után az étert ledesztilláljuk és a maradékot petroléterrel kristályosítjuk. 9,5 g (75%) BOC—Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)— —OH-t kapunk. Op.: 184—186 °C (etilacetát-hexánból átkristályosítva). Elemzés a C28H44N204 összegképlet alapján: számított: C =71,15%, H =9,38%, N = 5,93%, talált: C =71,38%, H =9,30%, N = 6,01%. BOC—Trp(2 ’,5 ’,7 ’-tri-tBu)-ONSu 12,0 g (25,4 mmól) BOC-Trp(2’,5’,7’-tBu)—OH-t és 2,95 g (25,7 mmól) N-hidroxiszukcinimidet oldunk 40 ml dioxánban, majd 5,3 (25,7 mmól) DCC-t adunk az oldathoz. 3 óra múlva a kivált DCU-t leszűrjük, az oldatot bepároljuk, a maradékot petroléterrel kristályosítjuk. Izopropilalkoholból átkristályosítva 11,4 g (79%) BOC—Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)-ONSu-t kapunk. Op.: 204-206 áC. Elemzés a C32H47N306 összegképlet alapján: számított: C = 67,46%, H = 8,32%, N = 7,38%, talált: C =67,65%, H = 8,50%, N = 7,46%. BOC—Trp(2 ’,5 ’,7 ’-tri-tBu)-Gly-OCH3 0,85 g (6,8 mmól) H-Gly-OCH3 • HCl-ot 10 ml dimetilformamidban szuszpendálunk, 0,95 ml (6,8 mmól) trietilamint, majd 10 perc keverés után 3,9 g (6,8 mmól) BOC-Trp(2’,5’,7’-tri-tBu)—ONSu-t adunk hozzá. A reakcióelegyet 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, másnap a dimetilformamidot ledesztilláljuk, a maradékot éterben oldjuk, n sósavval és 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal kirázzuk. Szárítás után az étert ledesztilláljuk és a maradékot vízzel eldörzsöljük. 3,5 g (95%) B OC -Trp(2’,5 ’,7’-tri-tBu)-Gly-OCH3 -t kapunk. Op.: 75—76 °C, Rf = 0,77. Z-Arg—Trp(2»5 ’,7 ’-tri-tBu)-Gly-OH 2,65 g (4,9 mmól) BOC-Trp(2\5\7’-tBu)-Gly-OCH3-t 8 ml ecetsav és 0,8 ml tömény sósav elegyében oldunk, 20 perc múlva az oldatot bepároljuk, a maradékhoz 50 ml étert és 30 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldatot adunk. Összerázás után a vizes réteget 20 ml éterrel mossuk, az egyesített éteres oldatot szárítjuk és bepároljuk. Az így nyert H-Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)—Gly-OCH3-t 10 ml dimetilformamidban oldjuk, 1,65 g (4,8 mmól) Z—Arg(HCl)—OH-ot, 0,65 g (4,8 mmól) N-hidroxibenztriazolt és 1,0 g (4,8 mmól) DCC-t adunk hozzá. Másnap a kivált DCU-t leszűijük és az oldatot bepároljuk. A nyers termékhez 50 ml etilacetátot és 20 ml vizet adunk, összerázás után az etilacetátos oldatot négyszer 20 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal, majd 20 ml vízzel mossuk. Szárítás után az etilacetátot ledeszíilláljuk és a maradékot petroléter hozzáadásával megszilárdítjuk. A Z—Arg—Trp(2’,5 ’,7 ’—tri-tBu)-Gly—OCH3 -t 30 ml etanolban oldj ide, 4,5 ml n nátriumhidroxidot adunk hozzá és szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 1 óra múlva a reakcióelegyet sósavval semlegesítjük, az etanolt ledesztilláljuk és a kristályos maradékot vízzel eldörzsöljük. 50%-os etanolból átkristályosítva 1,62 g (47%) Z—Arg—Trp(2 ’,5 ’,7 tri—tBu)—Gly—OH-t kapunk. Op.: 211-214 °C, R? =0,39. BOC—Ser—Tyr—Ser—Met-Glu(OtBu)-His—Phe— Arg—Trp(2 ’,5 ’,7 ’-tri-tBu)-Gly-OH 1,3 g (1,8 mmól) Z-Arg-Trp(2\5’,7’-tri-tBu)-Gly-OH-t 30 ml 80%-os ecetsavban oldunk és 0,20 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. Miután a reakció befejeződik a katalizátort kiszűrjük és az oldatot bepároljuk. A maradékot éter hozzáadásával megszilárdítjuk és leszűijük. Az így nyert H-Arg—Trp(2’,5’,7’-tri—tBu)-Gly-OH-diacetátot 10 ml dimetilformamidban oldjuk és az oldatot 1,08 ml (6,3 mmól) diizopropiletilaminnal meglúgosítjuk. 1,6 g (1,5 mmól) BOC—Ser-Tyr-Ser-Met-Glu—(OtBu)—His—Phe-N2 H3-ot 16 ml dimetilformamidban oldunk. Az oldatot —20 °C-ra hűtjük, 2,4 ml (6,0 mmól) 2,5 n etilacetátos sósavoldatot és 0,23 ml (1,93 mmól) terc-butilnitritet adunk hozzá, 5 percig —10 °C-on tartjuk, majd újra -20 °C-ra hűtjük és hozzáadjuk a H—Arg—Trp(2’,5’,7’—tri— —tBu)—Gly—OH diizopropiletilaminnal meglúgosí-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
