177132. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH hatású terc-butilezett triptfént tartalmazó peptidek előállítására
11 177132 12 (30,9 mmól) B0C-Arg(N02 )-OPFP-t adunk hozzá és a reakcióelegyet trietilamin adagolással 30 percig pH 8-on tartjuk. Az oldószer bepárlása után a maradékot 400 ml kloroformban oldjuk, háromszor 60 ml sósavval kirázzuk. Szárítás után az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, majd a nyers terméket kloroform-éter-ből átcsapjuk. 6,35 g (49%) BOC-Arg(N02)-Pro-NH2-ot kapunk. Rf =0,14. BOC—Arg(N02 )-Arg(N02 )-Pro-NH2 6,35 g (15,3 mmól) BOC-Arg(N02)-Pro-NH2- -ot 65 ml dioxánban oldunk és 65 ml 8 n dioxános sósavoldatot adunk hozzá, 30 perc múlva a dioxánt ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük és leszűrjük. Az így kapott dipeptidamid-hidrokloridot 40 ml dimetilformamidban oldjuk, trietilaminnal pH 8-ra lúgosítjuk 'és 8,16 g (16,8 mmól) BOC-Arg(N02)-OPFP-t adunk hozzá. A reakcióelegyet ezután 30 percig trietilamin adagolással pH 8-on tartjuk, majd az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, szüljük és 150 g szilikagélből készített oszlopon etilacetát: (piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 :11) = 75 :25 eleggyel kromatografáljuk. A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. 5,05 g (53,6%) BOC-Arg(N02)-Arg(N02)-Pro—NH2-ot kapunk. R? =0,18. Z—Lys(BOC)-Pro-Val-Gly—Lys(BOC)—Lys(BOC)—Arg(N02 )—Pro—NH2 5,05 g (8,2 mmól) BOC—Arg(N02 )-Arg(N02 )—Pro—NH2 -ot 50 ml trifluorecetsavban oldunk. Az oldatot 30 perc múlva bepároljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, szárítás után a tripeptidamid-trifluoracetátot 25 ml dimetilformamidban oldjuk, az oldatot diizopropiletilaminnal pH 8-ig lúgosítjuk és ezután még 3,44 ml (22,35 mmól) diizopropiletilamint adunk hozzá. 8,3 g (7,45 mmól) Z-Lys(BOC)-Pro- Val-Gly-Lys(BOC)-N2H3-ot [K. Sturm, R. Geiger, W, Siedel: Bér., 96., 609. (1963) K. Hofmann, I. Rosenthaler, R. P. Wells, H. Yajima: I. Am. Chem. Soc. 86., 4991. (1964)] 40 ml dimetilformamidban oldunk. Az oldatot —20 °C-ra hűtjük, 9,3 ml (29,8 mmól) 3,2 n etilacetátos sósavoldatot, majd 1,27 ml (10,7 mmól) terc-butilnitritet csepegtetünk bele. A reakcióelegyet 5 percig -10 °C-on tartjuk, majd újra -20°C-ra hűtjük és hozzáadjuk a H-Arg(N02 )~Arg(N02 )-Pro-NH2 diizopropiletilaminnal meglúgosított oldatát. 1 órán át -5 és 0°C közötti hőmérsékleten keverjük, majd másnapig 0 °C-on állni hagyjuk. A dimetilformamid ledesztillálása után a maradékot 300 ml kloroformban oldjuk, háromszor 50 ml n sósavval és háromszor 50 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal mossuk. A kloroformos oldatot szárítás után bepároljuk, a maradék éter alatt megszilárdul, leszűrjük, majd kloroform-éterből átcsapjuk. 9,3 g (79%) védett nonapeptid-amidot kapunk. Op : 134- —144 °C, Rj = 0,72. H—Lys(BOC)—Pro—Val-Gly—Lys(BOC)—Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-NH2 -tritozilát 9,3 g (5,85 mmól) Z-Lys(BOC)~Pro-Val-Gly-Ly s (BOC)-Lys(BOC)~Arg(N02 )-Arg(N02 )-Pro-NH2-ot 268 ml 80%-os ecetsavban oldunk és 2,6 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. Amikor a reakció befejeződik a katalizátort kiszűrjük és az oldatot bepároljuk. A maradékot 160 g szilikagélből készített oszlopon etilacetát: (piridin : ecetsav : víz = = 20:6:11) = 6:4 arányú elegy ével kromatografáljuk. A tiszta nonapeptidamidot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, az oldószert ledesztilláljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Az így kapott 4,85 g nonapeptidamid-triacetátot 50 ml piridinben oldjuk, 2,15 g (11,3 mmól) p-toluolszulfonsav-monohidrátot adunk hozzá, majd az oldatot bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, szárítás után 4,90 g (44%) nonapeptidamid-tritozilátot kapunk. Rf =0,13. BOC-Ser-Tyr-Ser—Met-Glu(OtBu)-His—Phe—- Arg-T rp( 1 ’-tBu)—Gly—Lys(BOC)—Pro—Val-Gly— —Lys(BOC)-Lys(BOC)-Aig—Aig—Pro—NH2- —tritozilát 0,908 g (0,6 mmól) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)—His—Phe-Arg-Trp( 1 ’-tBu)-Gly-OH-t és 1,13 g (0,6 mmól) H—Lys(BOC)—Pro—Val—Gly—Lys(BOC)—Lys(BOC)— Arg-Arg-Pro-NH2 tri-tozilátot 8 ml dimetilformamidban oldunk, 0,084 ml (0,6 mmól) trietilamint és 0,68 g (0,9 mmól) pentafluorfenol-DCC-3:l-komplexet adunk hozzá. 20 óra múlva a kivált DCU-t leszűrjük és a terméket éterrel kicsapjuk a szűrletből. 1.8 g (89%) védett nonadekapeptid-amid-tritozilátot kapunk. Rf =0,09. 2. példa H—Ser—Tyr-Ser—Met—Glu—His—Phe—Arg— —Trp(2 ’,5 ’,7 ’-tri—tBu)—Gly—Lys—Pro—-Val-Gly—Lys-Lys-Arg—Arg-Pro-NH2- —hexaacetát 1,15 g (0,33 mmól) BOC—Ser—'Tyr—Ser—Met-Glu(OtBu)-His-Phe~Arg-Trp(2’,5,,7’-tri—tBu)-Gly-Lys(BOC)—Pro-Val—Gly—Lys(BOC)— —Lys(BOC)-Arg-Arg—Pro-NH2 -tritozilátot 8.8 ml trifluorecetsav 1,1 ml anizol és 1,1 ml víz elegyében oldunk. Az oldatot lóra után’110ml éterrel hígítjuk és a kivált csapadékot leszűrjük. A nyers nonadekapeptidamid-trifluoracetátot 5 x 50 cm-es karboximetilcellulóz (Whatman CM 52) oszlopon 2 liter 0,3 mól (pH 6,7) és 2 liter 0,6 mól (pH 6,7) ammóniumacetát pufferből készített lineáris puffergradienssel kromatografáljuk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,405 g (38%) nonadekapeptídamid-hexaacetátot kapunk. Rf = 0,44, peptidtartalom = 78%, aminosav analízis: Lys: 3,0 (3), His: 1,0 (1), Arg 2,7 (3), Ser 1,8 (2), Glu: 1,0 .(1), Pro (1,9 (2), Gly 2,0 (2), Val 1,1 (1), Met 0,9 (1), Tyr 0,9 (1), Phe: 1,0 (1). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
