177132. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH hatású terc-butilezett triptfént tartalmazó peptidek előállítására
7 177132 8 ban. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vegyületeket enterális vagy parenterális beadásra alkalmas szervetlen vagy szerves vivőanyag kíséretében tartalmazzák. így a gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd liofilizátumok, ekkor vivő- 5 anyagként peptidekkel nem reagáló vegyületek - például szénhidrátok - jöhetnek számításba, lehetnek híg vagy tömény szuszpenziók és emulziók, amelyek különböző tartósító és stabilizáló segédanyagokat is tartalmaznak. 10 A gyógyszerkészítmények felhasználhatók diagnosztikumként a mellékvesekéreg funkcionális állapotának megállapítására. Terápiásán valamennyi csökkent ACTH termeléssel járó szindróma esetében alkalmazhatók. 15 A találmány szerinti eljárás foganatosítási módjait az alábbi példákkal szemléltetjük, A példákban az aminosav és peptidszármazékok jelölésére a IUPAC-IUB által ajánlott rövidítéseket használtuk [J. Biol. Chem. 247 977 (1972)]. ao Egyéb rövidítések: BOC = terc-butiloxikarboni!-, tBu = terc-butil-, NSu = N-szukcinimidil-, PFP = pentafluorfenil-, Z = benziloxikarbonilcsoport, DCC = didklohexil-karbodiimid, DCU = diciklohexilkarbamid, DCHA = diciklohexilamin, H-T rp( 1 tBu)-OH = 25 = Nin-terc-butil-triptofán, H—Trp(2’,5’,7’-tri—tBu)— -OH = 2\5’,7’-tri-terc-butil-triptofán. Az olvadáspont meghatározások dr, Tottoli-féle készülékben (Büchi, Schweiz) történik. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat kovasavgél (Silica- 30 gel nach Stahl) adszorbensen végeztük az alábbi oldószer-elegyekben: 1. etilacetát: (piridin : ecetsav : víz 2. etilacetát: (piridin : ecetsav : víz 3. etilacetát: (piridin : ecetsav : víz 4. etilacetát: (piridin : ecetsav : víz 5. n-butanol : piridin : ecetsav : víz = 20 :6 :11 ) = 99 :1 35 = 20:6:1!)= 9:1 = 20:6:11)= 8:2 40 = 20:6:11)= 6:4 = 30 :20 : 6 : 24 A peptidek ioncserélő kromatográfiás tisztítása- 45 nál UVICORD III (LKB, Svédország) átfolyó küvettás ultraibolya extinkcióméteren 280nm-en folyamatosan regisztráltuk az eluátum fényelnyelését. 25 ml-es frakciókat gyűjtöttük, a terméket tartalmazó frakciókat az elnyelési görbe alapján válasz- 50 tottuk ki. 1. példa H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu—His-Phe-Arg-Trp(l’—tBu)-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-NH2 -hexaacetát 1,12 g (0,33 mmól) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met- gp -Glu(OtBu)-His-Phe—Arg-Trp( 1 ’-tBu)-Gly-Lys(BOC)-Pro- Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)—Arg—Arg—Pro—NH2 -tritozilátot 7,7 ml trifluorecetsav és 3,3 ml víz elegyében oldunk. Az oldatot 3 óra után 110 ml éterrel hígítjuk és a kivált csapa- gj dékot leszűrjük. A nyers nonadekapeptidamid-trifluor-acetátot 5x50cm-es karboximetilcellulóz (Whatman CM 52) oszlopon 2 liter 0,3 mól (pH 6,7) és 2 liter 0,6 mól (pH 6,7) .ammóniumacetát pufferből készített lineáris puffergradienssel kromatografáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,435 g (41) nonadekapeptidamid-hexaacetátot kapunk. R| = 0,38, peptid tartalom = 75%, aminosav analízis: Lys 2,8 (3), His 1,0 (1), Arg 3,1 (3), Ser 1,8 (2), Glu 1,1 (1), Pro 2,1 (2), Gly 1,9 (2), Val 1,0 (1), Met 0,8 (1), Tyr 1,0 (1), Phe 1,1 (1), A kiindulási anyagként alkalmazott védett polipeptidet az alábbi módon állíthatjuk elő. Z—Trp( 1 ’—tBu)—OH • DCHA 60 ml metanolban oldott 49,8 g (147 mmól) Z-Trp-OH-t éteres diazometán oldattal észterezünk, majd az oldószert ledesztilláljuk és a visszamaradó Z-Trp—OCH3-t 300 ml metilénkloridban oldjuk. Az oldatot —10 °C-ra hűtjük, 900 ml izobutilént (10,2 mól), 4,5 ml (164 mmól) tömény kénsavat adunk hozzá és nyomásálló edényben 8 napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután 45 ml piridint adunk a reakcióelegyhez és bepároljuk. A maradékot 500 ml etilacetátban oldjuk, az oldatot 200 ml n sósavval, kétszer 200 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal, végül 200 ml vízzel kirázzuk és szárítjuk. Az etilacetát ledesztillálása után visszamaradó Z-Trp(l’-tBu)—OCH3-t (50,25 g, 84%) további tisztítás nélkül 500 ml etanolban oldjuk és 100 ml 2 n nátriumhidroxiddal 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd az oldatot tömény sósavval semlegesítjük, bepároljuk és a maradékot 200 ml éter és 1200 ml 3%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldat hozzáadásával feloldjuk. A vizes fázist még háromszor 200 ml éterrel mossuk, majd 500 ml étert öntünk hozzá és keverés közben tömény sósavval pH 3-ig savanyítjuk. A vizes réteget kétszer 200 ml éterrel mossuk. Az egyesített éteres oldatot szárítás után kb. 250 ml-re bepároljuk és diciklohexilaminnal meglúgosítjuk. A kikristályosodó sót leszűijük, acetonból átkristályosítjuk. 26,15 g (31%) Z—Trp(l’—tBu)—OH. DCHA sót kapunk. Op.: 146—147 °C, Rf = 0,65. Elemzés a C3SH49N304 összegképlet alapján: számított: C =73,01%, H =8,5%, N = 7,30%, talált: C =72,86%, H =8,65%, N = 7,25%. Z-Trp(l ’—tBu)-ONSu 8,6g (14,9mmól) Z-Trp(l’—tBu)-OH- DCHA sót 150 ml éterrel és 60 ml n kénsavval addig rázunk, amíg feloldódik. Az éteres oldatot 20 ml vízzel mossuk és szárítás után bepároljuk. A visszamaradó Z—Trp(l’—tBu)—OH-t 20 ml dioxánban oldjuk, 1,8 g (15,7 mmól) N-hidroxiszukcinimidet és 3,15 g(15,0 mmól) DCC-t adunk hozzá. 3 óra után a kivált DCU-t leszűijük, az oldatot bepároljuk. A maradék éter alatt megkristályosodik 6,8 g 4
