177098. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új peptidil ng-karboxi-L-arginin-aldehid-származékok előállítására
5 177098 6 Az antitrombin-aktivitásokat az alábbi rendszerben határoztuk meg: 0,2 ml 9,5%-os marha fibrinogén 0,9%-os konyhasó-oldatban, 0,1 ml TRIS • HCl puffer (pH = 7,4), mely a pepiidet tartalmazza, és 0,1 ml US Standard Human Thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA) 5 egység/ml-es oldatból. A rendszer alvadási ideje pepiid nélkül 15 mp. Az in vivo vizsgálatok eredményét a D-fenilalanil-L-prolil-NG-karboxi-L-arginin-aldehid (az I általános képletben X jelentése hidrogénatom, Y jelentése D-fenilalanin-csoport és Pro jelentése L-prolin-csoport példáján szemléltetjük. Öt állatfajon (egér, patkány, nyúl, kutya, majom) végzett vizsgálat bizonyította, hogy az I általános képletű - ahol X jelentése hidrogénatom, Y jelentése D-fenilalanin-csoport és Pro jelentése L-prolin-csoport - vegyület fokozott antitrombin hatása in vivo is megnyilvánul. Ez a hatás nemcsak intravénás, intramuszkuláris és szubkután, de orális adás mellett is igen jelentős. A H—D—Phe—Pro—Arg(COOH) -H in vivo antitrombin aktivitására jellemző, hogy kutyákban 50 mg/kg orális dózis a vér alvadási idejét - Thrombelastographban (Heilige, Wien, Ausztria) - 4-6-szorosra nyújtja, a hatás tartama kb. 2 óra. A megfelelő szabad tripeptid-aldehid sói, pl. a D-fenilalanil-L-propil-L-arginin-aldehid-klórhidrát, illetve -acetát 50 mg/kg orális dózisban gyakorlatilag nem befolyásolja a vér alvadási idejét. A fentiek alapján a találmány eljárás I általános képletű új, peptidil-NG-karboxi-L-arginin-aldehid-származékok és gyógyászatilag felhasználható savaddíciós sóik előállítására — ahol X jelentése hidrogénatom, benzoil- vagy terc-butiloxikarbonil-csoport, Y jelentése D-fenil-alanin-, /3-fenil-D-tejsavvagy D-allo-izoleucin-csoport és Pro jelentése L-prolin-csoport — guanidino-csoportján és N- illetve O-terminálisán hidrogenolízissel eltávolítható uretán-típusú védőcsoporttal, előnyösen benziloxikarbonil-csoporttal védett, vagy adott esetben N-terminálisán terc-butiloxikarbonil- vagy benzoil-csoporttal védett I általános képletű peptidil-L-arginin-aldehidekből a védőcsoport(ok) eltávolításával, mely abban áll, hogy a védőcsoport vagy védőcsoportok eltávolítását rövidszénláncú alkanol - víz 1 : 1-9 :1 - arányú elegyében katalitikus hidrogénezéssel végezzük és kívánt esetben a kapott bázist önmagában ismert módon gyógyászatilag felhasználható savval savaddíciós sóvá alakítjuk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy a guanidino-csoporton benziloxikarbonil-csoporttal védett L-arginin-laktámoí a megfelelő N-acil-dipeptiddel kondenzáljuk, s a keletkező védett tripeptid-laktámot redukáljuk. A kapott védett tripeptid-aldehid guanidino-csoportján levő, vagy adott esetben N-terminálisán és guanidino-csoportján levő benziloxikarbonil-csoportoí etanol-víz 3 :1 arányú elegyében csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezéssel lehasítjuk, majd ezt követően az oldatból csökkentett nyomáson kidesztilláljuk az etanolt, és a vizes oldatot liofilizáljuk. Kívánt esetben a liofílizátumot vízben oldjuk, és egy ekvivalensnél kevesebb sav hozzáadása után ismét liofilizáljuk. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. Az Rf értékeket szilikagél vékonyrétegkromatográfiával határoztuk meg (Kieselgel G, Reanal, Budapest) az alábbi rendszerekben: 1. etilacetát-piridin-ecetsav-víz - 480 : 20 : 6 :11 2. etilacetát-piridin-ecetsav-víz - 240 : 20 : 6 :11 3. etilacetát-piridin-ecetsav-víz - 60 :20 : 6 :11 4. etilacetát-piridin-ecetsav-víz - 30 :20 : 6 :11 1. példa D-Fenilalanil-L-prolil-NG-karboxi-L-arginin-aldehid előállítása (I képletben X jelentése hidrogénatom, Y jelentése D-fenilalanin-csoport és Pro jelentése L-prolin-csoport 1. lépés: terc-butiloxikarbonil-NG-benziloxikarbonil-L-arginin-laktám 41,4 g (125 mmól) terc-butiloxikarbonil-L-arginin-klórhidrát-hidrátot [Yamashiro és munkatársai: J. Am. Chem. Soc., 94, 2855 (1972)] feloldunk 125ml 4n nátrium-hidroxidban és -5 °C és 0°C közötti hőmérsékletre hűtjük. Erős keverés közben hozzáadunk 75 ml (500 mmól) klórszénsav-benzil-észtert és 125 ml 4 n nátrium-hidroxidot úgy, hogy a reakcióelegy pH-ja 10 felett legyen. Ezt követően a keverést 1,5 órán át 0°C körüli hőmérsékleten folytatjuk. A reakcióelegyet 100 ml vízzel hígítjuk és háromszor 100 ml dietiléterrel kirázzuk, majd jeges vízhűtés mellett 3-as pH-ra savanyítjuk 4—6°C-ra hűtött 3n kénsavval (kb. 130 ml szükséges). Az elkülönült terméket háromszor 250 ml etilacetáttal kirázzuk. Az egyesített etilacetátos oldatokat kétszer 125 ml 15%-os konyhasóoldattal mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot 300 ml dietiléterrel eldörzsöljük, szűrjük, és dietiléterrel történő mosás után levegőn szárítjuk. 37,5 g (76%) terc-butiloxikarbonil-NG-benziloxikarbonil-L-arginint kapunk, R? 0,17-0,27. A kapott terméket feloldjuk 130 ml tetrahidro-furánban, hozzáadunk 13,58 ml (97 mmól) trietilamint, és -10°C-ra hűtjük. Ezen a hőmérsékleten keverés közben hozzáadunk 12,8 ml (97 mmól) klórszénsav-izobutilésztert, majd 5 perc keverés után 13,6 ml (97,8 mmól) trietilamint. A reakcióelegyet tovább keverjük 1 órán át 0 °C-on, majd 1 órán át hűtés nélkül. Ezt követően 600 ml jeges vízre öntjük, a kivált anyagot szüljük, vízzel mossuk és foszfor-pentoxid mellett vákuum exszikkátorban szárítjuk. 32,7 g (91%, a Boc-Arg(HCl)-OH • H2 Cire számolva: 70%) cím szerinti terméket kapunk. R| 0,85-0,95, op.: 162-164 °C. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
