177098. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új peptidil ng-karboxi-L-arginin-aldehid-származékok előállítására
3 177098 4 állandóbb és nagyobb, mint a megfelelő aminosavsoirendű karboxil-csoportot nem tartalmazó peptidil-arginin-aldehid-sóké. Megállapítottuk, hogy ha a guanidino-csoportján hidrogenolízissel eltávolítható uretán-típusú védő- 5 csoporttal, pl. benziloxikarbonil-csoporttal ellátott I általános képletű védett peptidil-L-arginin-aldehidekről a védőcsoporto(ka)t semleges közegben hidrogenolízissel távolítjuk el, I általános képletű — ahol X, Y és Pro jelentése a fenti — peptidil-NG- 10 -karboxi-L-arginin-aldehidek keletkeznek. Például a benziloxikarbonil-D-fenilalanil-L- prolil-NG -benziloxikarbonil-L-arginin-aldehid [Z-D-Phe-Pro—Arg(Z)—H] sav vagy bázis adalék távollétében lefolytatott hidrogenolízisekor D-fenilalanil-L-prolil- 15 -NG -karboxi-L-arginin-aldehid [H-D-Phe—Pro—Arg(COOH)—H] keletkezik (az I általános képletben X jelentése hidrogénatom, Y és Pro jelentése D-fenilalanin- illetve L-prolin-csoport). Míg ettől eltérően, amint ismeretes, a benziloxikarbonil-csoport- 20 tál védett peptidil-arginin-aldehidek savas közegben végzett hidrogenolízise vagy bázikus közegben végzett hidrogenolízise és az ezt követő sóképzés szabad, NG-karboxil-csoportot nem tartalmazó peptidil-arginin-aldehid savaddíciós sókhoz vezet. Például a 25 Z-D-Phe-Pro-Arg(Z)-H-ból ilyen módon nyerték a H—D—Phe—Pro—Arg-H—klórhidrát ot illetve -acetátot (169 870 sz. magyar szabadalmi leírás). Abban az esetben, ha a kiindulási I általános képletű peptidil-L-arginin-aldehid N-terminálisát 30 uretán-típusú, terc-butiloxikarbonil-csoporttal vagy benzoil-csoporttal védjük, ezen csoportok a semleges közegben végzett hidrogenolízis során nem hasadnak le, így olyan I általános képletű vegyületek képződnek, ahol X jelentése terc-butiloxikarbonil- il- 35 letve benzoil-csoport. Az aminosav-csoportok és peptid-származékok fenti rövidítései megfelelnek a szakirodalomnak, pl. J. Biol. Chem., 247, 988 (1972), Z, Boc és Bz jelentése benzíloxikarboníl-, terc-butiloxikarbonil- il- 40 letve benzoil-csoport, Arg(Z) és Arg(COOH) jelentése NG-benziloxikarbonil- illetve N -karboxi-L-arginin-csoport. Azt találtuk továbbá, hogy az I általános képletű peptidil-NG-karboxi-L-arginin-aldehid-származékok enzimgátló hatása meglepő módon állandóbb és nagyobb, mint a megfelelő aminosavsorrendű szabad tripeptid-aldehid-sóké. Például a H-D-Phe—Pro-Arg(COOH)-H antitrombin aktivitása, a trombin + fibrinogén reakcióra gyakorolt gátló hatása nagyobb, mint a H-D—Phe-Pro-Arg-H-klórhidráté vagy -acetáté, mely utóbbiak enzimgátló hatása a szintézis körülményeitől függően változó. Puffer oldatban (pH = 7,4) 20 órán át tartó állás után az I általános képletű peptidil-NG-karboxi-arginín-L-aldehid antitrombin-aktivitása gyakorlatilag változatlan, míg a megfelelő szabad tripeptid-aldehid-sóké az eredetileg mért érték 10-20%-ára csökken. Az I általános képletű peptidil-NG-karboxi-L-arginin-aldehidek további meglepő tulajdonsága, hogy részleges protonálás (sóképzés) révén az enzimgátló hatás tovább fokozódik. Pl. a D-fenilalanil-L-propil-Ng -karboxi-L-arginin-aldehid-hemiklórhidrátj a ötször hatékonyabb, mint a sósavat nem tartalmazó vegyület. Az I általános képletű peptidil-NG-karboxi-L-arginin-aldehidek protonálásával csökken ugyan a vegyületek stabilitása, de még mindig nagyobb aktivitást mutatnak puffer-oldatban való 20 óra állás után, mint a megfelelő aminosavsorrendű szabad tripeptid-aldehid-sók. A fentiek szemléltetésére az I. táblázatban bemutatjuk a D-fenilalanil-L-prolil-NG-karboxi-L-arginin-aldehidnek és hemiklórhidrátjának — az I általános képletben X jelentése hidrogénatom, Y jelentése D-fenilalanin-csoport és Pro jelentése L-prolin-csoport — valamint a megfelelő aminosavsorrendű szabad tripeptid-aldehid két sójának antitrombin-aktivitását és az aktivitás változását TRIS • CHI pufferben (pH = 7,4) való állás után, továbbá a vegyületeknek a H-D-Phe—Pro—Arg(COOH)—H-ra vonatkoztatott relatív aktivitását (ez utóbbi aktivitása = 100). Az antitrombin-aktivitást azzal az anyagmennyiséggel jellemezzük, amely a fibrinogén trombinnal indukált alvadási idejének tízszeres megnyújtásához szükséges. I. táblázat Tripeptid-aldehid-származékok antitrombin-aktivitása Az alvadási idő tízszeres megnyújtásához szükséges anyagmennyiség pg/ml-ben a peptid feloldása után Peptid-származék közvetlenül 20 óra múlva pg/ml (ra+) pg/ml (ra+) H -D—Phe—Pro - Arg(COOH)-H 0,275 (100) 0,300 (92) H -D -Phe -Pro - Arg(COOH)-H • 0,5 HC1 0,050 (550) 0,350 (79) H- D Phe -Pro-Arg-H • 2 HCla 0,35-0,95 (79-29) 6,0 (5) H -D-Phe-Pro-Arg-H • 2 CH3COOHb 0,37-1,25 (73-22) 6,2 (4) +ra = relatív aktivitás aZ-D-Phe-Pro-Arg(Z)-H savas közegben végzett hidrogenolízisével nyert termék. bZ-D-Phe-Pro-Arg(Z)—H bázikus közegben végzett hidrogenolízisével és az ezt követő sóképzéssel nyert termék. 65 2
