176799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin és pankreatin egyidejű kinyerésére sertéspankreászból
3 176799 4 dezaktiválódásban a pH-érték beállításához alkalmazott szerves, illetve szervetlen sav okozza a fő nehézséget. Erre a felismerésre a 2 146 275 számú német szövetségi köztársaságbeli közzétételi iratban mutatnak rá. Az inzulin kinyerését a pankreatinon kívül fagyasztással szárított pankreatin nyersanyagból végzik. A zsírtalanított, liofilizált hasnyálmirigyből víztartalmú szerves oldószerrel —■ előnyösen 60—80%-os etanollal — semleges só, így nátriumklorid hozzáadása után közvetlen sav beadagolása nélkül az inzulint extrahálják. Az 1 913 869 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat az enzimaktivitás és -stabilitás növelése céljából laktózt és anorganikus sókat ismertet. Az utóbbiak kationjaként csak a nátrium-kation szerepel, amely a savas jellegű kísérőanyagokkal disszociáló vegyületeket képez. Hasonló eljárást ismertet a 2 000 133 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat is, amely nátrium-ionok helyett ammonium kationokat használ. Az inzulin extrakciója friss vagy mélyhűtött hasnyálmirigyből nátriumklorid vagy ammóniumklorid sók hozzáadása után a 2 779 706 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásból ismeretes. A leírt eljárások lényeges hátránya részben az, hogy az inzulin-hozam értéke alacsony, részben az enzimek dezaktiválódása vagy a technológiai bonyolultsági fok és az ezzel járó költséges eljárási lépések, mint például a fagyasztva szárítás közbeiktatása. A találmány szerinti eljárás pankreatin mellett inzulin egyidejű kinyerésére friss vagy mélyfagyasztott sertéshasnyálmirigyből, a hasnyálmirigy aceton jelenlétében történő extrakció útján azzal jellemezhető, hogy az extrakcióhoz 40—80 térfogat% acetont tartalmazó aceton—víz elegyet alkalmazunk, és az extrakciót 5—■ 7 pH-értéken végezzük, amikoris a pH-értéket az inzulin savas jellegű kísérőanyagaival az adott extrakciós feltételek mellett nem disszociáló vegyületek képzésére alkalmas kationokat tartalmazó vízoldható sók és kívánt esetben e sók kationjaival nem disszociáló sók képzésére alkalmas anionokat tartalmazó vízoldható savanyú sók hozzáadásával állíthatjuk be, majd az extrakció után a szilárdanyagot, kívánt esetben további aceton hozzáadása után, elkülönítjük az extrakciós elegyből, az extrahált anyagot ismert módon feldolgozzuk inzulinná és a szilárdanyagot az extrakciós közegből történő elkülönítése után haladéktalanul 5,6 és 10 közötti pH- értékre állítva ismert módon pankreatinná dolgozzuk fel. A javasolt eljárással az ismert módszerekből származó nehézségek elkerülhetők. Meglepő módon ugyanis arra a felismerésre jutottunk, hogy az inzulin extrakciója friss vagy mélyhűtéssel konzervált hasnyálmirigyből igen kímélő körülmények mellett történhet, ha a felaprított hasnyálmirigyet, amelyet víz és aceton elegyében szuszpendálunk, egy sóoldattal kezeljük, amelynek kationja a hasnyálmirigy beltartalmi anyagaival oly módon képes reagálni, hogy a reakciókeverékből hidrogénionok szabaduljanak fel, amelyek a pH-eltolódást okozzák. A hidrogénionok felszabadításához elsősorban zsírsavak jönnek számításba, amelyek fémionokkal nem disszociáló vegyületet képeznek. A fémionoknak fiziológiás szempontból elviselhetőnek kell lenni, mivel többnyire nem kerülhető el, hogy a sómaradék a pankreatinban maradjon. Kevésbé alkalmazhatók olyan fémionok, főként nehézfémionok, amelyek a végtermékek hormon-, illetve enzimaktivitását befolyásolnák. Célszerűen vízoldható kalciumsókat, azonban magnézium-, cink-, alumínium-, vas-, kobalt-, nikkel-, ón- és mangánsókat is alkalmazhatunk. A hozzáadandó só mennyiségét pH-érték méréssel határozzuk meg. A kalciumsókat, főként a kalciumkloridot részben jó oldhatósága, másrészt jó fiziológiai elviselhetősége miatt alkalmazzuk. Előnyös mellékhatás a kalciumionok ismert enzimstabilizáló tulajdonsága. így például körülbelül 0,7% kalciumklorid hozzáadásával az aceton—víz elegyben szuszpendált hasnyálmirigynél a pH-értéknek olyan változása következik be, hogy 5—6, előnyösen 5,4—5,6 pH-értéket ér el. Ezek már olyan pH-értéknek felelnek meg, amelyeknél a hasnyálmirigy érzékeny enzimjei kimutatható károsodást nem szenvednek. Ez a hatás adott esetben egy alkalmas só hozzáadásával erősíthető, ha a sónak kalciumsóval történő kémiai reakciójánál hidrogénionok felszabadulása megy végbe. Savanyú sóként alkalmasak a többbázisú savak, ha a megfelelő kalciumsók, amelyek reakció közben képződnek, gyengén vagy — a fenálló feltételek mellett—egyáltalában nem disszociálnak. Erre a célra például a nátrium-dihidrogénfoszfát, vagy a dinátrium-hidrogénfoszfát felel meg. Más semleges sók, így nátriumklorid vagy ammóniumklorid és ehhez hasonló sók hozzáadása, amelyeket esetlegesen inzulin extrakciójánál más eljárásban alkalmaznak, nem hatnak a találmány szerinti eljárásnál sem zavaróan és adott esetben alkalmazhatók. A találmány szerinti eljárást például az alábbi módon végezzük : A friss vagy mélyhűtéssel konzervált sertés-hasnyálmirigyet felaprítjuk és 24 térfogat% víz és 76 térfogat% acetonból álló adott esetben az említett semleges sókkal vagy több-bázisú savak, előbb említett sóival kezelt közegben szuszpendálunk. A 40 és 80 térfogat% aceton koncentráció elősegíti az inzulin kioldását a hasnyálmirigy nyersanyagból, másrészt az ún. zimogének aktiválódását autolitikus folyamatok következtében a kiindulási nyersanyagban meggátolja. Az extrakciós folyadék térfogatát a gyakorlatban mérlegeléssel állítjuk be, figyelembe vesszük a hatóanyag megfelelő oldhatóságát és a szuszpenzió előnyös ipari kezelhetőségét. Különösen előnyös az az eljárási változat, amelynél a szuszpenzió szilárdanyag-tartalma 10 és 20% közötti. Ehhez a keverékhez ezután célszerűen először a kalciumsót, előnyösen vizes oldat alakjában adagoljuk. A kívánt pH-értékre előnyösen 5 és 7 vagy 5,4 és 5,6 közötti pH-értékre beállított szuszpenziót keverjük. A megfelelő extrakciós idő — amennyiben szokásos keverős reaktorban dolgozunk — körülbelül 0,5—1,5 óra. Ezután a szílárdanyagokat célszerűen centrifugálással leválasztjuk. A szilárdanyagot a találmány szerinti eljárással többször extrahálhatjuk, az extrakciólépések számát a pankreatin jó minőségének megőrzése érdekében viszonylag alacsonyra választjuk. A derített extraktumokat adott esetben egyesítjük és alkálikus oldatokkal 7 és 8, előnyösen 7,3—7,7 pH-értékre állítjuk be. A pH-érték beállításához gyenge ammóniás vizet, nátriumhidroxidot vagy egy alkálikus kémhatással hidrolizáló sót, így például dinátrium“ -hidrogénfoszfát vizes oldatát alkalmazzuk. Az adott esetben kiflokkulálódó inert fehérjefrakciót oentrifu* gálással elválasztjuk. Az átlátszó extraktumot ismét megsavanyítjuk, vákuumban az acetont eltávolítjuk, zsírtalanítjuk, a koncentrált anyagot konyhasóval kis-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
