176623. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kalcitoninszerű új polipeptidek előállítására
9 176623 10 szárítva nyers termékként 1,4 g j-----------------------(CH2)j------------------------1-CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCO-Val-Leu-Gly-Lys(CICbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzI)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)*Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2-t kapunk. Ezt a nyers terméket 0°-on 90 percig hidrogénfluoriddal és 15 ml 1:1 arányú fenol—anizol eleggyel reagáltatjuk. A hidrogénfluorid ledesztillálása után a maradékot etilacetáttal és benzollal mossuk és a megszilárdult terméket 1 mólos ecetsav-oldatban feloldjuk. Az oldatot Dowex lxl (acetát-fázis) műgyantával töltött oszlopon átbocsátjuk, és az eluátumot fagyasztva szárítva 870 mg poralakú terméket kapunk. 870 mg fenti terméket Sephadex G—50 gélszűréssel, CM-cellulózon ionkromatografálással és Sephadex LH—20-on gélszűréssel tisztítva 200 mg terméket kapunk. Aktivitása 3450 MRC egység/mg. Rf-értéke: 0,71 (Merck-cellulózon, n-butanolpiridin-AcOH-víz 15: 10: 3: 12 arányú elegyével). Aminosav-összetétel: Lys 0,91 (2), His 0,92, Arg 0,93, Asp 1,02 (2), Thr 0,73 (4), Ser 1,00 (3), Glu 1,00 (3), Pro 0,99 (2), Gly 0,92 (3), Ala 1,11, Val 0,90 (2), Leu 0,78 (5), Tyr 0,96, a-aminoszuberinsav 0,97. A kiindulási anyagot a következő módon állítjuk elő : 10—31. aminosavakból álló peptid szekvencia BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu--His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 1. BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2 220 ml tetrahidrofuránhoz hozzáadunk 67,7 g BOC-Thr(Bzl)-OH-t 33,0 g H-Pro-NH2-HCl-t és 29,6 g 1-hidroxibenzotriazolt, majd —5°-on hűtés közben 40,0 ml N-etil-N'-dimetilaminopropil-karbodiimidet adunk hozzá, és 1 óra hosszat —5°-on, majd éjjelen át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a reakciókeveréket bepároljuk,*a maradékhoz 800 ml etilacetátot adunk és kétszer 400 ml n sósavval és kétszer 300 ml 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és végül vízzel mossuk. A szerves réteget vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A kapott olajos maradékot 450 g kovasavgéilel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást 1: 1 arányú benzol—etilacetát eleggyel, majd ugyanilyen arányú etilacetát és metanol eleggyel végezzük, és az eluált frakciókat kovasavgélen vékonyrétegkromatografálással vizsgáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, 500 ml etilacetátban feloldjuk, majd kétszer 300 ml 5%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és végül vízzel mossuk. Vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, vákuumban bepároljuk és a maradékot n-hexánnal eldörzsölve fehér por alakjában 54,5 g (61,4%) BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2-t kapunk. Rj=0,48. [«]d = — 14,0° (c— 1, dimetilformamidban). 2. BOC-Ala-Gly-OBzl 450 ml tetrahidrofuránban feloldunk 94,6 g BOC-Ala-OH-t, 168,8 g H-Gly-OBzl-Tos-OH-t és 67,6 g 1-hidroxibenzotriazolt, hozzáadunk 91,5 ml N-etil-N'-dimetilaminopropil-karbodiimidet, majd a reakciókeveréket 0°-on 1 óra hosszat, és szobahőmérsékleten éjszakán át keverjük. Ezután a reakciókeveréket vákuumban bepároljuk, és a maradékot 800 ml etilacetátban feloldjuk. Hozzáadunk 500 ml n sósavat, a keletkezett csapadékot szűréssel elválasztjuk, az etilacetátos réteget egymás után 400 ml n sósavval, kétszer 5%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és végül vízzel mossuk. Vízmentes magnéziumszulfáton történő szárítás után vákuumban bepároljuk. A maradékot n-hexánnal eldörzsölve 152,5 g nyers terméket kapunk. Etilacetát és n-hexán elegyéből kétszer átkristályosítva 144 g (85,7%) BOC-Ala-Gly-OBzl-t kapunk. Olvadáspontja 87—88,5°. Vékonyrétegkromatografálással egyetlen foltot kapunk. RJ =0,59. 3. BOC-Ala-Gly-OH 500 ml tetrahidrofuránban feloldunk 101 g BOC-Ala-Gly-OBzl-t, és 7 g, 5% palládiumot tartalmazó szén jelenlétében hidrogénezzük. 6 óra elteltével a katalizátort eltávolítjuk, az oldatot bepároljuk, a maradékot 800 ml tetrahidrofuránban feloldjuk és 6 g, 5% palládiumot tartalmazó szén jelenlétében újra hidrogénezzük. Négy óra elteltével a katalizátort eltávolítjuk, az oldatot vákuumban bepároljuk és a maradékot n-hexánnal eldörzsöljük, mire az megszilárdul. Etilacetát, tetrahidrofurán és n-hexán elegyéből átkristályosítva 72 g (97,4%) BOC-Ala-Gly-OH-t kapunk. Olvadáspontja 129—132°. Vékonyrétegkromatografálással egyetlen foltot kapunk. [a]o =—8,87° (c=l, dimetilformamidban). 4. BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 30 ml trifluorecetsavhoz — 5°-on hozzáadunk 10,0 g BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2-t, 30 percig keverjük, majd vákuumban bepároljuk. A maradékhoz dietilétert adunk, a csapadékot szűrőn elválasztjuk és fémnátriumon szárítva H-Thr(Bzl)-Pro-NH2.TFA-t kapunk. 100 ml tetrahidrofuránhoz hozzáadjuk a 3. pont szerint előállított 6,08 g BOC-Ala-Gly-OH-t és 3,34 g 1-hidroxi-benzotriazolt, majd —5°-on hozzáadunk 4,5 ml 4,0 pH-jú N-etil-N'-dimetilaminopropil-karbodiimidet, és 1 óra hosszat —5°-on, majd 7 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük és — 5°-on hűtve 0,8 ml N-etil-N'-dimetilaminopropil-karbodiimidet adunk hozzá, pH-ját 4,0-ra állítjuk be, és 1 óra hosszat —5°-on, majd éjjelen át szobahőmérsékleten keverjük. Vákuumban bepároljuk, a maradékot 400 ml etilacetátban feloldjuk és egymás után telített nátríumklorid-oldattal, kétszer 100 ml, 5%-os vizes nátriumhídrogénkarbonát-oldattal, nátriumkloriddal telített, 100 ml n-sósawal és 50 ml vízzel mossuk. Az etilacetátos réteget vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk és a vizes réteget kloroformmal extraháljuk. A kloroformos kivonatot vízzel kétszer mossuk és az etilacetátos réteggel egyesítjük. Az egyesített szerves rétegeket vákuumban bepároljuk és a maradékot 150 g kovasavgélen kromatografáljuk. Az oszlopon etilacetátot és metanolt vezetünk át. A metanolos eluátumot vákuumban bepároljuk, a maradékhoz n-hexánt adunk, hogy a BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 kikristályosodjék. Olvadáspontja 106—116°. Kitermelés 11,5 g (87,3%). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
