176623. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kalcitoninszerű új polipeptidek előállítására

7

176623

8

DIP

dfizopropilmetoxikarbonilcsoport,

Cbz

benziloxikarbonilcsoport,

CICbz

o-klórbenziloxikarbonilcsoport,

Bzl

benzilcsoport,

HOSU

N-hidroxiszukcinilimid,

Tos

tozilcsoport,

OEt

etoxicsoport,

OBzJ

benzoxicsoport,

ONP

p-nitrofenoxicsoport,

osu

N-hidroxiszukciniliminêszter,

Phe

L-fenilalanin,

Ser

L-szerin,

Asn

L-aszparagin,

Leu

L-leucin,

Thr

. L-treonin,

Val

L-valin,.

Pro

L-prolin,

Arg

L-arginin,

Asp

L-aszpara ginsav,

Ala

L-alanin,

Gly

glicin,

Lys

, L-lizin,

Gin

L-glutamin,

Glu

L-glutaminsav,

His

L-hisztidin,

Tyr

L-tirozin,

OBu

terc-butoxicsoport,

Met

L-metionin,

Be

L-izoleucin,

TFA

trifluorecetsav,

TosOH

p-toluolszulfonsav,

CHA

ciklohexilamin,

DCHA

diciklohexilamin,

THF

tetrahidrofurán,

DMF

dimetilformamid,

AcOEt

etilacetát,

DCC

diciklohexilkarbodiimid,

WSC

N-etil-N'-dimetilaminopropil-karbodiimid.

HOBT

1-hidroxibenzotriazol,

MeOH

metanol,

EtOH

etanol,

AcOH

ecetsav.

A következő példák szemléltetik a találmány szerinti eljárást. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban adjuk meg.

A szérum kalciumszintjét csökkentő hatás meghatározási módszerét, a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok során használt hordozóanyagokat és kifejlesztőszereket, valamint az aminosavelemzési módszert a következőkben adjuk meg.

Meghatározási módszer

A vizsgálandó vegyület mintáját 0,1 n nátriumacetáttal készült 0,1%-os albuminoldattal megfelelően hígítjuk. A kétszeres hígításokból minden esetben 0,2 ml-t intravénásán hím patkányokba fecskendezünk. Az injekció után egy órával az összes patkányt megöljük és vérüket felfogjuk. Minden egyes vérmintában abszorpciós spektrofotometria segítségével meghatározzuk a szénun kalciumszintjét. Másrészt sertés pajzsmirigyéből előállított kivonatot („Research Standard B”) 2,5, 5,10, illetve 20 MRC m egység/0,2 ml értékre hígítjuk. Mindegyik hígításból 0,2 ml-t intravénásán hím patkányokba

fecskendezünk, és a fenti módon az injekció után egy órával meghatározzuk a patkányok szérumában a kalciumszintet. A megfelelő alapoldat (Research Standard) hatékonyságához viszonyítva meghatározzuk a mintában a kalcitonin hatékonyságot.

Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok :

Hordozó: kovasavgél G lemez.

Kifejlesztőszerek :

1. CHClj—MeOH—AcOH 95: 5: 3

2. CHCI3— MeOH—AcOH 85:15: 5

3. CHCI3—MeOH—AcOH 85:10: 5

4. CHCI3—MeOH—AcOH 80: 25: 2

5. CHCI3—EtOH—AcOEt 5:2:5

6. CHCI3—MeOH—AcOH—H20 10:10:1:1

(alsó réteg)

7. benzol—AcOEt 2:1

8. n-butanol—piridin—AcOH—H20 15:10: 3:12

9. MeOH.

Aminosav-analízis :

A mintát 6 n sósavval (néhány csepp anizol jelenlétében) 110°-on 40—45 óra hosszat hidrolizáljuk, majd szárítjuk, és ezután meghatározzuk az aminosavösszetételt.

1. példa

j--------------(CH2)5---------------J-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly--Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr--Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2

1 g (0,27 mmól) BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 polipeptidet feloldunk — 5°-on, csökkentett nyomáson 10 ml trifluorecetsavban és hozzáadunk 1 ml, 4 n sósav-dioxán-elegyet. Ezután 40 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd vákuumban bepároljuk és etilétert« adunk hozzá. A kivált csapadékot nátriumhidroxidon szárítjuk. A száraz csapadékot 5 ml dimetilformamidban feloldjuk és hűtés közben trietilamin hozzáadásával pH-értékét 7-re állítjuk. Ehhez az oldathoz vizet adunk. A kivált csapadékot foszforpentoxidon szárítva BOC-mentes vegyületet kapunk szabad bázisként.

400 mg

p—-----------------(CH^---------—----—-j-CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCBGO-Val-Leu-Gly-OH-t feloldunk 2 ml dimetilformariSöban, majd hozzáadunk 90 mg N-hidroxiszukcinilimidet és hűtés közben 120 mg diciklohexilkarbodiimidet és éjszakán át keverjük. A kivált karbamidot kiszűrjük és a kapott oldatot hozzáadjuk a fenti BOC-mentes szabad bázishoz, majd oldószerként további 5 mg dimetilformamidot adunk hozzá. Három nap múlva a reakciókeverékhez vizet adunk és a kivált csapadékot kiszűrjük, etilacetáttal és etiléterrel mossuk, és meg-5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

4