176482. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinek rögzítésére hordozóanyagokon
5 176482 6 A találmány szerinti eljárással az iminklorid vizes oldatban közvetlenül reagáltatható a biológiailag aktív proteinnel. Ez esetben célszerűen úgy járunk el, hogy a biológiailag aktív proteint alkalmas vizes pufferoldatban oldjuk, hozzáadjuk a szilárd iminkloridot, és a reagenseket hagyjuk lereagálni. Ez a módszer főként akkor ajánlatos, ha az imin elágazott-szerkezetű, például 3, 4, vagy még több funkciót tartalmazó poliamid. Az ilyen esetben fellépő szférikus viszonyok között az iminklorid és a protein közötti direkt reakció serkentett. Ezzel szemben nyíltszénláncú polimerek esetében a reakció a proteinnel célszerűen valamely, legalább egy primer aminocsoportot tartalmazó közbenső vegyületen („spacer”) keresztül végezhető. A primer aminocsoport közvetlenül kapcsolódhat szénatomhoz vagy hidrazincsoportban, vagyis savamidcsoporthoz kötötten lehet jelen. Abban az esetben, ha két aminocsoport van jelen, akkor a két aminocsoportot egymástól előnyösen 2—-8 szénatomos a,w-dioxialkiIénvagy dikarbonsavamidcsoportnak kell elválasztania. Ha diamid helyett monoamidot használunk, akkor ez egy további funkcionális csoportot, előnyösen egy proteinnel képezett kötés kialakítására alkalmas csoportot tartalmaz. A közbenső vegyület e második csoportja — attól függetlenül, hogy primer aminocsoportról vagy egyéb csoportról van szó — ismét reagálható egy bifunkciós protein-reagenssel, mielőtt még a protein végleges megkötése megtörténne. Ilyen vegyületek például a dialdehidek, mint glutáraldehid, dihidroszukcinimidészter, diacetálok, bisz-maleinimidek, bifunkciós iminoészterek, mint dietilmalonimidát, dimetiladipinimidát, diepoxidok, dikarbonsavkloridok, különösen «, ß-telitetlen dikarbonsavdikloridok, diizocianátok, diizotiocianátok és hasonlók. E vegyületek célszerűen 2—-12 szénatomosak, de hosszabb szénláncúak is lehetnek. Elhagyható ez a második közbenső vegyület, ha az iminoklorid csoportot olyan heterobifunkciós reagenssel reagáltatjuk közvetlenül, amelynek egyik funkciója a polimer aminocsoportból, másik funkciója pedig olyan védett csoportból áll, amely szabad alakjában képes proteinnel reagálni, mint például acetálcsoport ; savasan, hidrogenolízissel vagy enyhén bázikusan elszappanosítható észtercsoport ; vagy ilyen csoport kialakítására alkalmas csoport, mint nitrilcsoport iminoésztercsoport esetében, olefin epoxidcsoport esetében; és egyéb csoportok. Ha maga a közbenső vegyület nem folyékony, akkor az iminklorid reakcióját a legalább egy aminocsoportot tartalmazó bifunkcionális közbenső vegyülettel valamely szerves oldószerben végezzük. Az ellenkező esetben a közbenső vegyület szolgál folyékony fázisként. A reakció vizes közegben is végezhető, mert a primer aminocsoport gyorsabban reagál az iminkloriddal, mint az OH-csoport. Ha a primer aminocsoport savamid csoporthoz kötött, vagyis valamely hidrazidról van szó, akkor dimetilszulfoxid, formamid vagy dimetilformamid oldószerben hajtjuk végre a reakciót. Egyéb, erősen poláros oldószerek is alkalmazhatók ebben az esetben. A találmány szerinti eljárás biológiailag aktív proteinek olyan hordozóanyagokra történő lekötését és rögzítését teszi lehetővé, amelyek molekulájukban szekunder aminocsoportot tartalmaznak. A rögzítés kíméletes módon, az előnyös tulajdonságok — különösen a hordozóanyag felületi tulajdonságainak — megtartása mellett történik. Az eljárás alkalmas mind a proteineknek az intermedier képződött iminkloridcsoportokhoz, mind azok közbenső vegyületeken (spacerek) keresztül történő kapcsolására, mely utóbbi esetben a közbenső vegyületek a proteint bizonyos távolságban tartják a tulajdonképpeni hordozóanyagtól. A proteinnek a legalább egy primer aminocsoportot tartalmazó bifunkciós vegyület szabad funkciójához kötése — mint már említettük — történhet közvetlenül, vagy egy további bifunkciós proteinreagensen keresztül. A proteinreagensnek „spacer” szerepe van, vagyis növeli a hordozóanyag és a protein közötti távolságot, ahol ez kívánatos, vagy pedig protein-térhálósítószerként hat, amely több biológiailag aktív proteinmolekulát köt össze egymással, és az így kapott térhálós protein-aggregátumokat rögzítjük azután a hordozóra. Ez a rögzítés történhet ugyanazon többfunkciós proteinreagensen, egy másik proteinreagensen keresztül, vagy történhet a legalább egy primer aminocsoportot tartalmazó több funkciós vegyület második, proteinkötésre alkalmas funkciójával közvetlenül. Alkalmas, többfunkciós proteinreagensek például a glutárdialdehid, bisz-hidroxiszukcinimidészter és más, a szakember számára ismeretes vegyületek. A többfunkciós, ill. polifunkciós reagensnek két vagy több proteinnel reagáló funkcionális csoportja lehet. Alkalmas ilyen polifunkciós proteinreagenseket neveznek meg például a 2 237 083 és 1 915 970 számú német szövetségi köztársaságbeli közzétételi iratok. A találmány szerinti eljárás utóbbi foganatosítási módját a 11. és 13. példák szemléltetik. A 11. kiviteli példa szerint a biológiailag aktív proteint szukcinimidészterrel térhálósítjuk, és ezután glutárdialdehiddel mint bifunkciós proteinreagenssel egy olyan diamin szabad aminocsoportjához kapcsoljuk, amelynek második primer aminocsoportját előzetesen az iminoklorid-csoporttal reagáltattuk. Mivel a szukcinimidészter kb. 100- szor reakcióképesebb, mint a glutárdialdehid, másrészt viszont sokkal drágább is, ezért ily módon a térhálósítással nagyobb aktivitási-kitermelés érhető el, ugyanakkor azonban az olcsóbb glutárdialdehiddel végrehajtható egyidejűén a polimerre történő kötés. Egyetlen polifunkciós proteinreagenssel végzett egyidejű térhálósítást és rögzítést szemléltet a 13. kiviteli példa. A találmány szerinti eljárás egy további foganatosítási módja abban áll, hogy valamely hordozóanyag, mint szövedék, szálak, kémcsövek, vagy egyéb kívánt hordozóanyag felületére ragasztóréteget viszünk fel, majd arra elektromos úton poliamidport, -pelyhet és hasonlókat hordunk fel. Az ily módon előállított nagy felület azután a proteinrögzítés találmány szerinti eljárásával a porral bevont hordozónak nagy fajlagos aktivitást kölcsönöz. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példák világítják meg. 1. és 2. példa 2—2 m hosszú, 1 mm belső átmérőjű nylon-6 csövet előbb abszolút metanollal, majd abszolút metilénkloriddal a nedvességnyomok eltávolítása végett kiöblítettünk. Ezután a csöveket —40 C°-ra lehűtöttük, és megtöltöttük PC15 5%-os, CCI4-0S —40 C°-os oldatával. A hő5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
