176482. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinek rögzítésére hordozóanyagokon
7 176482 8 fok pontos betartása nem kritikus paraméter, de —20 C -pál alacsonyabb hőfok, előnyös. A PCl5-oldatot 5 óra eltelte után leszívattuk, és a reagens fölöslegét vízmentes CCl4-dal végzett öblítéssel távolítottuk el. Ezután az egyik csőbe etiléndiamint, a másikba oxálsavdihidrazid 2%-os dimetilszulfoxidos oldatát töltöttük. 2 órás állás után a csöveket egy éjszakán át vízzel öblítettük. Ezután a maradék víz eltávolítása végett a csöveket abszolút dioxánnal öblítettük, és 50 mg etilénglikol-bisz-propionsav-bisz-hidroxiszukcinimidészter 2,5 ml dioxánnal és 0,5 ml N-etilmorfolinnal készült oldatát töltöttük beléjük. 30 perc.múlva az oldatot leszjvattuk, és a csöveket 0,,1 mólos, 8,5 pH-jú trietanolaminnal öblítettük. Ezután 2 mg glukóz-dehidrogenáz 1 ml 8,5 pH-jú trietanolamin-pufferral készült oldatát töltöttük beléjük, és a csöveket ezjzel az oldattal 3 órán át 4 C'-on állni hagytuk. Ezt követően 5 liter, NaCl-raegy mólos, 0,1 mólos, 8,5 pH- jú trietanolamin-pufferral öblítettük ki őket. Az etilén - diaminnal : kezelt cső 1,5 U/m, az oxálsavhidrazjddal kezelt cső 1,6 U/m aktivitást mutatott. 3. példa Két mézeres nylon-6, csövet az 1. kiviteli példában leírt módon; aktiváltunk. Az enzimrögzítésnél 2 mg GOD. 1 ml 7,8 pH-jú foszfát-pufferral készült oldatát használtuk, majd a csövet az 1. kiviteli példában leírt módon öblítettük. 7 ml/perc átfolyási sebességnél vizsgálva a cső 1,5 U/m aktivitást mutatott. 4. példa , 50 g nylon-6 granulátumot abszolút metanollal, majd abszojút metilénkloriddal öblítettünk a nedvességnyomok eltávolítása céljából. A — 40 C°rra hűtött granulátumot —40 C -os, 5%-os CCI4-0S POj oldattal öntöttük le, és kevertük. 5 órás, —40 C°-on végzett keverés után leszívattuk, és a reagens fölöslegét vízmentes CCl4-dal mostuk ki. Ezután a granulátumhoz hexametiléndiamin 20%-os CH3OH-os oldatát adtuk, és 2 óra múlva az oldatot leszívattuk. Ezután a granulátumot egy oszlopba töltöttük, és éjszakán át vízzel öblítettük. Ezt követően a granulátumot 12 percig 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borátpufferral készített 10%-os glutárdialdehid oldattal kevertük. Az oldatot leszívattuk, a granulátumot 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral öblítettük. Az aktivált granulátum 10 g-jához ezután 80 mg GOD 40 ml 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral készített oldatát adtuk, és abban 3 órán át 4 C°-on kevertük. A granulátumot ezután oszlopba töltöttük, és 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral, amely NaCl-ra 1 mólos volt, mostuk. A granulátum ezután 240 U/g aktivitást mutatott. 5. példa Két méter hosszú, 1 mm belső átmérőjű nyloncsövet — 30 C°-ra hűtöttünk, és —30 C°-os, 10%-os, CCl4-os PClj-oldattal töltöttünk meg. 5 óra múlva vízmentes metilénkloriddal öblítettük, és ezután azonnal 5 ml GOD/ml koncentrációjú, 0,3 mólos, 8,0 pH-jú TRA pufferral készült glukózoxidáz-oldatot töltöttünk belé. 3 órán át 4 C°-on tartottuk a csövet, majd NaCl-ra 1 mólos, 0,1 mólos, 7,0 pH-jú foszfátpufferral öblítettük. Az így előállított GOD-cső aktivitása 7 ml/perc átfolyási sebességgel vizsgálva 0,15 U/m volt. 6. példa Két méteres nyloncsövet az 1. kiviteli példában leírt módon aktiváltunk. „Spacer”-ként 0,3%-os, dimetilszulfoxidos borostyánkősav-hidrazidot, bifunkciós protein-reagensként pedig glutárdialdehidet használtunk. A rögzítéshez 2 mg glicerokinaze 1 ml 7,8 pEI-jú foszfátpufferral készített oldatát használtuk, majd a csövet az 1. kiviteli példában leírt módon öblítettük. A cső 7 ml/perc átfolyási sebességgel vizsgálva 0,4 U/m aktivitást mutatott. 7. példa 5 g nylon-6 granulátumot 20 ml széntetrakloridban szuszpendáltunk. Ezután szobahőmérsékleten 25 percen át foszgént buborékoltattunk át a szuszpenzión, majd a nylon-granulátumot széntetrakloriddal mostuk, és a kapott nylon-poliiminkloridhoz 10 mg glukózoxidáz 10 ml, 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral készült oldatát adtuk. A granulátum a 4. kiviteli példában leírt módon végzett mosás után 50 U/g aktivitást mutatott. 8. példa 8,4 g PClj 40 ml benzollal készült oldatához keverés közben 10 g poliamid-6 port adtunk, és egy éjszakán át 4 C°-on tartottuk az elegyet. Ezután a reaktív iminklorid közbenső termék elválasztása nélkül a reakcióelegyhez 20 ml benzolban oldott 2,4 g hexametiléndiamint adtunk, és azt 2 órán át visszafolyató hűtő alkalmazása mellett forraltuk. Ezt követően a reakcióelegyet leszűrtük, etanollal mostuk, majd rövid vizes desztillált mosás után az aktivált származék 0,5 g-ját 1 ml olyan oldathoz adtuk, amelyet 20 mg glukózoxidázból 1 ml 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral készítettünk. Éjszakán át 4 G°-on állni hagytuk, majd NaCI-ra 1 mólos, 7,0 pH-jú, 0,1 mólos foszfátpufferral mostuk. A rögzített glukózoxidáz-nylonszármazék aktivitása 41 U/g volt, ami 25 U/ml aktivitásnak felelt meg. 9. példa A 8. kiviteli példában leírt módon 10 g poliamid-6 port PClj-dal, majd ezt követően hexametiléndiamin-oldattal reagál ta ttunk. A kondenzált diamin második aminocsoportjának szabaddá tétele után 0,5 n NaOH-n gyorsan átmostuk, a terméket hidroxilion-mentesre mostuk, majd 15 perc múlva glutárdialdehid 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borát pufferral készült 10%-os oldatát adtuk hozzá. További desztillált vizes mosás után az aktivált nylon-termék 5 g-jához 20 mg glukózoxidáz 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfát pufferral készült 5 ml oldatát adtuk hozzá. Éjszakán át állni hagytuk 4 C°-on, leszívattuk, és NaCl-ra 1 mólos, 7,8 pH-jú, 0,1 mólos foszfátpufferral mostuk. A rögzített glukózoxidáz aktivitása 78 U/g volt, ami 48 U/tnl-nek felelt meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
