176482. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinek rögzítésére hordozóanyagokon
3 176482 4 szekunder aminocsoportot tartalmazó anyagokhoz történő rögzítését anélkül, hogy e biológiailag aktív proteinek aktivitása csökkenne, illetve a fentiekben említett eljárások hátrányai jelentkeznének. Ezt a feladatot a találmány szerint biológiailag aktív proteinek rögzítésére szolgáló olyan eljárással oldjuk meg, amelyet az jellemez, hogy 7000—120 000 molekulasúlyú poliamidhordozót — vagy az említett poliamiddal bevont egyéb hordozót — 80 és 50 C° közötti hőmérsékleten szervetlen klórozó-szerrel klórozunk, ily módon a szekunder aminocsoportokat I általános képletű — mely képletben R és R, jelentése 1—12 szénatomos egyenes, elágazó szénláncú és/vagy ciklikus alkilcsoport, illetve alkiléncsoport, fenilcsoport, illetve feniléncsoport vagy alkilfenilcsoport, illetve alkilénfeniléncsoport, ahol az alkilcsoport legfeljebb 6 szénatomos, amelyek egymáshoz egy vagy több szekunder vagy tercier aminocsoporton, észtercsoporton, amidcsoporton vagy iminkloridcsoporton keresztül kapcsolódnak, vagy természetes és/vagy szintetikus aminosavakból álló peptidláncok — iminklorid-csoport tartalmú vegyületté alakítjuk át, és az így kapott terméket a) vizes oldatban közvetlenül reagál tatjuk valamely biológiailag aktív proteinnel, vagy b) valamely, legalább egy primer aminocsoportot vagy hidrazidcsoportot tartalmazó, ismert bifunkciós vegyület — amelynek másik funkciós csoportja amino-, hidrazid-, acetál-, észter-, nitril- vagy olefincsoportból áll — egy mólos feleslegével reagáltatjuk, adott esetben vizes vagy szerves oldószerben, majd az így kapott, II általános képletű — mely képletben R2 jelentése alkilén-, a,o>dioxi-alkilén- vagy 2—8 szénatomos dikarbonsavamidcsoport és X jelentése primer amino-, hidrazid-,acetál-, észter-, nitril- vagy olefincsoport —csoportokat tartalmazó terméket vagy közvetlenül a proteinnel vagy először legalább egy ismert bifunkciós vagy polifunkciós protein-reagenssel — így dialdehiddel, diacetállal, bisz-maleinimiddel, bisz-iminoészterrel, diepoxiddal, dikarbonsavkloriddal, diizocianáttal vagy diizotiocianáttal-, majd ezután a proteinnel vagy a proteinnek a protein-reagenssel képezett reakciótermékével reagáltatjuk, emellett adott esetben olyan hordozóanyagot alkalmazunk, amelynek felülete poliamid rostokkal vagy -pelyhekkel bevont. A találmány szerinti eljárásban az iminklórozási reakciót előnyösen folyékony vagy szilárd polimerrel, előnyösen nylonnal vagy perionnal és hasonlókkal hajtjuk végre. További alkalmas, szekunder aminocsoport tartalmú polimerek a poliuretánok. Szilárd halmazállapotú polimerek esetében célszerű a polimert oldott állapotban reagáltatni. E célra alkalmasak a szakember számára ismert, szokásos oldószerek. Ha a szekunder aminocsoporttartalmú polimer szilárd halmazállapotban van, úgy reagáltatható por, vagy valamely formatest, például cső alakban. Ha a formatest felülete aránylag kicsiny a tömegéhez képest, akkor célszerű a reagáltatandó felületet aktiválni. Az aktiválás előnyösen úgy végezhető, hogy a felületre finomeloszlású polimert csapunk ki oldatából. így a poliamidokat, például nylont alkalmas oldószerben oldjuk, és finomeloszlású amorf és így reakcióképesebb alakban csapjuk ki a műanyag formatest felületére. Hasonló módon arra is lehetőség van, hogy olyan formatestekre, amelyek szekunder aminocsoportokat nem tartalmazó polimerekből készültek, szekunder aminocsoportokat tartalmazó polimerekből bevonatokat hordjunk fel. Ez előnyösen szintén a polimer oldatból végzett kicsapásával történhet. Arra is lehetőség van, hogy a szokásos bevonat-képzési módszerekkel, ráextrudálással, folyadék halmazállapotban végzett felhordással, ráolvasztással, fólia-felhordással és hasonló módszerekkel járjunk el. A találmány szerinti eljárásban nemcsak polimerek, hanem általában minden, protein-hordozóanyagként számításba vehető, több szekunder aminocsoportot tartalmazó vegyület is felhasználható, így például a peptidek is. Az iminklorid előállítására előnyösen használható klórozószer a PC15. Egyéb alkalmas klórozószerek például a PC13, SOCl2, COCl2, POCl3 és S02C12. A két utóbbi anyag ugyan nem olyan reakcióképes mint a PClj, de a PClj-dal szemben előnyük, hogy folyékony halmazállapotúak, és ezért oldószer alkalmazása nélkül használhatók. Ha a klórozást PCl5-dal végezzük, akkor oldószer alkalmazása szükséges. Alkalmas oldószerek a halogénezett oldószerek, mint diklóretán, metilénklorid, kloroform, széntetraklorid és hasonlók. Különösen előelőnyösen kivitelezhető az iminklorid előállítása PC15- dal diklóretánban —38 és 0 C° közötti hőmérsékleten. Ezek az előnyös reakciókörülmények úgy biztosíthatók, hogy a diklóretános (vagy egyéb halogénezett oldószeres) oldathoz szárazjeget keverünk. Természetesen egyéb hűtési módszerek is alkalmazhatók. A reakció befejeződése után, a diamin hozzáadása előtt a klórozószer-fölösleget eltávolítjuk. Alternatív módon azonban az is lehetséges, hogy a klórozószer fölöslegének előzetes eltávolítása nélkül, a klórozást közvetlenül követően a reakcióelegyhez adjuk a legalább egy primer aminocsoportot tartalmazó bifunkciós vegyületet, amennyiben az nem kapcsolódik közvetlenül a biológiailag aktív proteinhez. Abban az esetben, ha a klórozószert a bifunkciós vegyület hozzáadása előtt nem távolítjuk el, akkor a klórozószer fölöslege a bifunkciós vegyülettel reagálhat. Ha bifunkciós vegyületként például valamely diamint használunk, akkor a halogénezőszer fölöslege a második szabad aminocsoporttal reagálhat. Ha egy ilyen közbenső terméket ezután a proteinnel reagáltatunk, akkor a proteinnel a klórozószerfölöslegnek a bifunkciós vegyület szabad funkcionális csoportjaival végbement reakciója következtében képződött csoportok is reagálhatnak. Ha például klórozószerként foszforpentakloridot használunk, és az iminklorid-képzés után ennek fölöslegét nem távolítjuk el, akkor az enzim a diamin szabad aminocsoportjaivál kondenzált foszforsavklorid csoportokon keresztül kötődhet meg. Megállapítottuk, hogy a protein rögzítés során ilyen körülmények között is nagy kitermelés érhető el a biológiai aktivitás tekintetében (lásd 8. kiviteli példa). Tipikus olyan vegyületek, melyek a találmány szerinti eljárással iminkloridcsoportok képződésén át biológiailag aktív proteinekhez kapcsolhatók, a 6-poliamid, 6,6-poliamid, 6,10-poliamid, 11-poliamid, 12-poliamid, poli-ciklikus amidok, mint a poli(l,4-ciklohexiléndimetilénszuperamid), polidodekanollaktám, gyapjú, kazein, természetes selyem, poliarginin és hasonlók. A szintetikus polimerek közül előnyösen azok használhatók, amelyekben R és Rj jelentése olyan 6—12 szénatomos alkilén- és cikloalkiléncsoport, amelyeket amidcsoportok kötnek össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
