176462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergolin-származékok előállítására fermentációs úton
9 176462 10 5. példa 10 darab 2 literes üvegfermentort beoltunk a 2. példa szerint készített szubmerz-spóratenyészettel. Minden fermentor 1,3 liter A) tápoldatot tartalmaz. [A) tápoldat: 10% szacharóz, 1,5% ammóniumcitrát, 0,05% káliumdihidrogénfoszfát, 0,03% magnéziumszulfát, 0,001% vas(II)-szulfát, 0,0004% cinkszulfát, csapvíz, pH = 5,5, sterilizálás 30 percig 0,5 atm nyomáson.] A fermentációt 24 °C hőmérsékleten, 400 U/perc keveréssel, illetve 0,3 liter levegő/perc befúvatással végezzük. 7 nap múlva az egyik fermentor tartalmát 10 liter B) táptalajt tartalmazó 18 literes nemesacél fermentorba áthelyezzük. [B) tápoldat: 10% szacharóz, 1,4% citromsav, 1,0% 25%-os ammóniumhidroxid-oldat, 0,05% kalciumnitrát, 0,025% káliumdihidrogénfoszfát, 0,01% káliumklorid, 0,03% magnéziumszulfát, 0,001% vas(II)-szulfát, 0,0004% cinkszulfát, csapvíz, pH = 5,5.] A tenyésztést 24 °C-on, 360 U/perc keveréssel és 2,5 liter levegő/perc átfúvatással végezzük. Az 5. napon a fermentor tartalmának felét inokulumként alkalmazzuk 40 liter C) tápoldatot tartalmazó 63 literes nemesfém-fermentorhoz. [C) tápoldat: 20% szacharóz, 1,75% citromsav, 0,075% káliumdihidrogénfoszfát, 0,02% káliumklorid, 0,03% magnéziumszulfát, 0,0012% cinkszulfát, csapvíz, ammóniumhidroxid-oldattal pH beállítás 5,3-ra, sterilizálás 60 percig 110°C hőmér-, sékleten.] A tenyészetet 7 napig 24 °C hőmérsékleten 300 U/perc sebességgel keveijük és 27 liter levegőt/perc vezetünk át a tenyészeten, és szükséges esetben hozzáadunk habzásgátló-szert. A tenyésztés befejeztével a tenyészfolyadék 2640 mg összalkaloidát tartalmaz literenként. A 4. példa szerint végzett analízis szerint ebből 1300 mg az ergotoxin és 550 mg az ergometrin. 6 6. példa A 3. példa szerint tenyésztett oltóanyag-tenyészet spóra-mennyiségét inokulumként elosztjuk két darab 18 literes nemesfém-fermentorban levő 10-10 liternyi A) táptalajban (lásd az 5. példát). A fermentorok tartalmát 7 napig 24 °C hőmérsékleten 260 U/perc sebességgel keveijük és 2,5 liter levegőt/perc vezetünk át rajtuk. Ezután a két fermentor tartalmát áthelyezzük 250 literes nemesfém-fermentorba, amely 180 liter B) tápoldatot (lásd az 5. példát) tartalmaz, és a tenyésztést folytatjuk 24 °C hőmérsékleten 160 U/perc-es keveréssel és 0,5 liter levegőt/liter tápoldat x perc átfúvatva. 5 nap múlva áthelyezzük a tenyészetet 1400 liter C) tápoldatot (lásd az 5. példát), valamint 0,0005% nikkelszulfátot is tartalmazó 2000 literes nemesfém-fermentorba. A tenyésztést 24 °C hőmérsékleten 160 U/perc keverési sebességgel és 1 liter tápoldatra vonatkoztatva, 0,6 liter levegőt/perc vezetünk át a tenyészeten. Szükség esetén mindegyik fermentorba még adagolhatunk habzásgátló-szert is. A 7. napon a tenyészet 2430 mg összalkaloidát tartalmaz tenyészfolyadék-literenként. A 4. példa szerint végzett analízis szerint ebből 1150 mg az ergotoxin és 490 mg az ergometrin tenyészfolyadék-literenként. 7. példa A 6. példa szerint előállított tenyészfolyadékhoz a micélium elválasztása előtt 1 : 1 térfogatarányban keverés közben vizet adunk, majd leszűijük a micéliumot. 200 liter üy módon kapott tenyésztési szűrletet 25%-os ammóniumhidroxid-oldattal pH = 8,5-re lúgosítunk, majd az ergotoxin-alkaloidát és az ergometrint kétlépcsős ellenáramú extrakciós berendezésben 50 liter etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetát-extraktumot vákuumban 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten a kiindulási térfogat 1/20-adára töményítjük és a kapott maradékhoz 2 térfogatrész kloroformot adunk. A reakcióelegyet 15 óra hosszat +4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, miközben az ergometrin-kloroform-addukt kikristályosodik. A kristályokat leszívatjuk és így kapunk 35,4 g (75%) sárgás ergometrin-kloroform-adduktot. 35,4 g ergometrin-kloroform-adduktot aktív szén jelenlétében, melegítés közben feloldunk 3,1 liter acetonban, leszűijük az aktív szenet és a szűrlethez számított mennyiségű maleinsav acetonos oldatát adjuk. A kapott kristályos ergometrin-dimaleinátsót leszívatjuk és +70 °C-on szárítjuk. Az alkaloidsót vékonyrétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér-sárgás kristályos por alakjában kapjuk, 90%-os kitermeléssel, 98—100%-os tisztaságú fokkal. [a]p° =+50° (c= 1, vízben). A kapott ergotoxin-tartalmú szűrletet tovább koncentráljuk 0,297 literre, majd a) az alkaloida-koncentrátum összalkaloid-menynyiségére számított 20-szoros mennyiségű semleges I aktivitási fokú alumíniumoxid-oszlopon etilacetáttal kromatografáljuk, majd 3,8 liter etilacetáttal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten szárazra pároljuk, a kapott 74,2g-nyi bepárlási maradékot feloldjuk 0,212 liter benzolban és az oldatot 15 óra hosszat +4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A kiváló ergotoxin-benzol-adduktot leszívatjuk, benzollal mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 55,2 g vékonyrétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér, kristályos ergotoxin-benzol-adduktot kapunk, amelynek 95%-os a tisztasági foka. [“Id =—183° (c= 1,8, kloroformban), vagy b) az alkaloida-koncentrátum összalkaloid-menynyiségére számított 20-szoros mennyiségű semleges I aktivitási fokú alumíniumoxiddal addig keveijük, amíg a reakcióelegy homogén színűvé válik. A reakcióelegyet 10 percig állni hagyjuk, majd háromszor 3,82 liter etilacetáttal extraháljuk. Az egyesített extraktumot +30 °C hőmérsékleten szárazra pároljuk, és a további feldolgozást az a) pontban leírtak szerint végezzük. így kapunk 52,5 g vékonyrétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér, kristályos ergotoxin-benzol-adduktot, amelynek 95%-os a tisztasági foka. [a]p° = -183° (c= 1,8, kloroformban), vagy c) az alkaloida-koncentrátum összalkaloid-menynyiségére számított 5-szörös mennyiségű semleges I aktivitási fokú alumíniumoxid + aktív-szén-oszlopon (adszorbensek aránya: alumíniumoxid : aktív-szén= 5:1) etilacetáttal kromatografáljuk, majd 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
