176399. lajstromszámú szabadalom • Eljárás baktériumsejtanyag előállítására
7 176399 8 1. példa A Methylomonas dara FH-B— 5460 ATCC 31226 jelű törzset tenyésztéshez a következő összetételű táptalajt tartalmazó ferde csövecskékben 5 tartjuk: Agár 85%-os foszforsav 12%-os ammónium-hidroxid-oldat dinátrium-hidrogén-foszfát kénsav magnézi um-szulfát-heptahidrát vas(II)-szulfát-heptahidrát metanol (a csövecskék betöltése előtt adjuk hozzá) nyomelem-oldatx víz A táptalaj pH-ja sterilizálás előtt: 18 g, 2.0 ml, 3.0 ml, 10 0,01 g, 1,2 g, 0,8 g, 0,3 g, 15 10 ml, 1.0 ml, 1 liter. 6,7. 80 XA nyomelem-oldat réz(II)-szulfitot (CuS03), bórsavat (H3B03), mangán(II).-szulfátot (MnSQ4), cink-szulfátot (ZnS04) és nátrium- molibdátot (Na2Mo04) tartalmaz. A fenti összetételű táptalajt tartalmazó ferde csövecskéket autoklávban 30 perdg 120°C-on tartjuk. Ezt követően a csövecskéket Methylomonas clara-val oltjuk be és 2 napig 37 °C-on tartjuk. Két 30 csövecskéről 10 ml fiziológiás konyhasó-oldattal lemossuk a sejtanyagot, és a következő fokozatra átoltjuk. Ez a fokozat egy rázatott kultúra (elő-kultúra), amelynél 2 literes, az előző táptalajból (agar 35 nélkül) 1 litert tartalmazó Erlenmeyer lombikot alkalmazunk, és amelyhez 3,3 ml (sterilre szűrt) metanolt adunk. Ezt a kultúrát három napon át 37 °C-on 220 fordulat/perc fordulatszám és 4 cm-es amplitúdó beállításával rázatjuk. 24 és 48 óra után 40 3,3-3,3 ml metanolt adunk a kultúrához. A következő tenyésztési fokozatot (fő-kultúra) 25 liter térfogatú fermentorban hajtjuk végre. A fermentorba mintegy 20 liter fenti összetételű táptalajt öntünk (metanolt és agart azonban nem 45 tartalmaz). Sterilizádó (30 perc 120°C-on és 1,2—1,4 bar nyomáson) után a fermentort 2 liter elő-kultúrával oltjuk be. A lapos keverővei, levegőztető koszorúval és három beavatkozó nyílással ellátott fermentorban a következő fermentációs 50 körülményeket állítjuk be: hőmérséklet levegőztetés nyomás fordulatszám PH 37 °C, 10 liter/perc, 0,5 wm, 0,2 bar, 500 fordulat/perc 6,6. 55 20 ml -metanolt kimérünk, és minden esetben, ha a sejtek széndioxid-kibocsátása csökken, további 60 20 ml metanolt adagolunk a fermentorba. A metanol koncentrádó eközben nem lesz nagyobb 0,1 térfogatszázaléknál. 22 óra eltelte után a fő-kultúra 20 liter fermentádós elegyével egy 200 literes elő-fermentorban 65 levő táptalajt oltunk be. Ezt a fermentort éppen úgy kezeljük, mint a fő-kultúrát. A fermentor kiképzése is megegyező. A fermentációs körülmények a következők: hőmérséklet levegőztetés nyomás fordulatszám PH 37 °C, 6-8 m3 /óra, 0,5-0,75 wm, 0,2 bar, 380 fordulat/perc, 6,7. A fermentációs elegy pH-ját steril ammónium-hidroxid-oldattal (10%-os) tartjuk 6,7—6,8 értéken. A metanol-beadagolást a fermentorból kijövő levegő metanol koncentrádójának lángionizációs detektor segítségével történő mérése útján szabályozzuk. A metanol koncentráció 50 ppm alá süllyedése esetén újból adagolunk be metanolt. Ha az eltávozó levegőben 600 vpm a metanol koncentráció, akkor az oldatban 0,22% metanol van. 20 óráig tartó fermentáció után az elő-fermentor 200 liter fermentációs elegyével egy fő-fermentort oltunk be, ez 2000 liter táptalajt tartalmaz, és a következő üzemi adatokkal rendelkezik: hőmérséklet levegőztetés nyomás fordulatszám PH 37 °C, 60—80 m3/óra, 0,5—0,75 wm 0,2 bar, 170 fordulat/perc 6,7. A metanol beadagolás a 200 literes elő-fermentomál megadott módon történik. A metanol koncentrádót a táptalajban 50-80 ppm értéken tartjuk. 22 óra fermentációs idő után learatjuk a baktériumsejtanyagot. Ehhez a fermentációs elegy pH-ját hígított kénsav hozzáadásával .4,0 értékre állítjuk be, és a sejtanyagot 400 fordulat/perc fordulatszámmal szeparátorokban lecentrifugáljuk. A centrifugálást 6,5-6,8 pH-nál is el lehet végezni. A lecentrifugált sejtanyagot (szárazanyag tartalom = 20%) vízzel mossuk, és ezután szeparátorban 25% szárazanyag tartalomig centrifugáljuk. Ezt követően a sejtanyagot porlasztásos szárítóban 120—150 °C belépő hőmérséklettel megszárítjuk. Az így kapott por még mintegy 1,5-3,5% maradék nedvességet és (a nitrogén tartalom x 6,25 képlettel számolva) 85% nyers proteint, 74% aminosavat, melynek mintegy 50%-a esszenciális aminosav, 8-12% nukleinsavat, 6—8% nyers zsírt és 5—6% nyers hamut tartalmaz (a százalékok súlyszázalékot jelentenek). 2. példa A Methylomonas dara FH—B—5460 ATCC 31226 jelű törzset az 1. példában leírt módon tenyésztjük. A fő-fermentor egy 3000 literes, a folyamatos fermentádóra kialakított, állandóan levégőztetett fermentor. Üzemi adatai a következők: 4
