176294. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének és antitestek meghatározására
11 176294 12 keskeny küvettában végezzük, a reakcióelegy mozgatását célszerűen például olyan módon biztosítjuk, hogy egy botot függőlegesen vagy keresztirányban a küvettában mozgatunk. Természetesen úgy is eljárhatunk, hogy az érzékenyített hordozórészecskéket és a meghatározandó mintát a küvettán kívül reagáltatjuk meghatározott ideig, pontosan meghatározott körülmények között, majd pedig a reakcióelegyet az extinkció mérése céljából a küvettába töltjük. Annak érdekében azonban, hogy valamennyi mérésnél a reakciókörülmények reprodukálhatók legyenek, és az elsősorban a reakcióidő szempontjából lényeges, az érzékenyített hordozórészecskéket speciális körülmények között” közvetlenül egy olyan küvettában reagáltathatjuk, amelyet spektrofotométerben helyezünk el. Ilyen módon pontosabb meghatározásra nyílik mód, mivel az extinkciót közvetlenül egy előzetesen meghatározott reakcióidő letelte után meghatározhatjuk, vagy pedig azt az időt mérhetjük, amely ahhoz szükséges, hogy az extinkció egy előzetesen megállapított értéket érjen el, miközben a reakciót pontosan definiált körülmények között hajtjuk végre. A találmány szerint tehát nemcsak a mintában jelenlevő antigén és/vagy antitest koncentrációja határozható meg — ez eddig csak vizuálisan, fél-kvantitatív módon volt lehetséges —, hanem nyomokban jelenlevő antigén és/vagy antitest is meghatározható — ez eddig csak a radioimmun-vizsgálat segítségével volt megoldható —, olyan pontossággal, amely megfelel a radioimmun-vizsgálatnál elérhető értéknek. Az ismeretlen mennyiségű antigént és/vagy antitestet tartalmazó minta antigén- és/vagy antitest-tartalmának találmány szerinti meghatározásához híg kalibrációs mintasorozatot készítünk olyan standard minta alkalmazásával, amely meghatározott mennyiségű megfelelő antigént és/vagy antitestet tartalmaz. A standard minta különböző mértékű hígításával állítjuk elő a kalibrációs oldatokat. Ezután minden egyes hígított kalibrációs mintát vagy hígítatlan standard mintát előre meghatározott körülmények között oldhatatlan hordozórészecskékkel reagáltatunk, amelyet meghatározott mennyiségű megfelelő antitesttel vagy antigénnel érzékenyítettünk. Minden egyes reakcióelegynek megmérjük az extinkcióját, és kalibrációs görbét állítunk fel a standard antigénből és/vagy antitestből, valamint az érzékenyített hordozórészecskékből álló kombinációra vonatkozólag. A kalibrációs görbe összefüggést ad az antigén vagy az antitest mennyisége (koncentrációja) és az extinkció között (a kalibrációs görbéknek ezt a típusát a következőkben az egyszerűség kedvéért „A” kalibrációs görbe elnevezéssel jelöljük). Ezután egy meghatározni kívánt ismeretlen mintát reagáltatunk ugyanolyan érzékenyített hordozórészecskékkel, amilyeneket a kalibrációs görbe felvételéhez használtunk, lényegében az ott alkalmazott körülményekkel megegyező körülmények között, és mérjük a reakcióelegy extinkcióját. Az ismeretlen mintában jelenlevő, meghatározni kívánt antitest és/vagy antigén mennyiségét (vagy koncentrációját) úgy kapjuk meg, hogy az ilyen módon mért extinkció-értéket összehasonlítjuk az „A” kalibrációs görbével. Úgy is eljárhatunk a kalibrációs görbe fenti módon történő felvételekor, hogy olyan kalibrációs görbét veszünk fel, amely az alkalmazott kalibrációs mintákban jelenlevő antigén vagy antitest mennyisége (vagy koncentrációja) és egy előre meghatározott extinkció-érték eléréséhez szükséges reakcióidő közötti összefüggést ábrázolja (a kalibrációs görbéknek ezt a típusát az egyszerűség kedvéért a következőkben „B” kalibrációs görbének nevezzük. Ebben az esetben is a mintában jelenlevő antigén és/vagy antitest meghatározását úgy végezhetjük, hogy az ismeretlen mintát ugyanolyan érzékenyített hordozórészecskékkel reagáltatjuk és lényegében azonos körülmények között, mint a kalibrációs görbe felvételénél alkalmazottak, és mérjük az előre megállapított extinkció-érték eléréséhez szükséges időt. A találmány szerint tehát az ismeretlen mintában jelenlevő antigén és/vagy antitest mennyiségét vagy koncentrációját úgy határozhatjuk meg, hogy A) mérjük az ismeretlen mintával készített reakcióelegy extinkcióját (és a kalibrációhoz az „A” kalibrációs görbét alkalmazzuk), vagy B) meghatározzuk a reakciósebességet vagy egy előre megállapított extinkció-érték eléréséhez szükséges reakcióidőt (és a kalibrációhoz a „B” kalibrációs görbét használjuk). Amint arra már utaltunk, a fenti A) módszer, mint igen nagy pontosságú meghatározás, nemcsak abban az esetben használható, ha az antitest és/vagy antigén koncentrációja viszonylag nagy az ismeretlen mintában, hanem akkor is, ha az olyan csekély, hogy az ismert eljárások közül csupán a radioimmun-vizsgálat segítségével volna meghatározható. Másrészt, a fenti B) módszer alkalmas arra, hogy alkalmazásával az ismeretlen mintában viszonylag nagy mennyiségben (vagy koncentrációban) jelenlevő antigént és/vagy antitestet határozzuk meg. Különleges előnyt jelent az, hogy a mérés meglehetősen egyszerű. Amint arra már korábban utaltunk, az „A” kalibrációs görbe egyenes vonal helyett kissé S-alakú, ez azonban nem befolyásolja hátrányosan a meghatározás pontosságát. A kalibrációs görbe S-alakjának az oka valószínűleg az, hogy - amint ezt említettük - kisebb antigén- és/vagy antitestkoncentrációknál a reakciósebesség befolyásolja a görbe alakját, ugyanakkor nagyobb koncentrációknál a hordozó anyag aktív helyeinek telítődése következik be. Természetesen lehetőség van arra, hogy megnöveljük az S-alakú görbe lineáris szakaszát, a kalibrációs görbe felvételénél, alkalmazott körülmények gondos megválasztásával, és az ismeretlen minták meghatározása során gyakorlatilag ebben a tartományban dolgozunk. Amint fentebb már kifejtettük, a találmány szerint úgy járunk el, hogy lehetőleg nagy koncentrációban alkalmazott érzékenyített hordozórészecskéket a mintával érintkezésbe hozzuk, és azzal reagáltatjuk. Ezért olyan szélességű küvett$t alkalmazunk a reakcióelegy extinkciójának meghatáro-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
