176294. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének és antitestek meghatározására
7 176294 8 0,481 mikrométer átlagos átmérőjű antifibrinogén-polisztirol-latexrészecskék alkalmazásával lett felvéve. A 8. ábra egy 1,2 mikrométer hullámhosszon felvett extinkciós görbét mutat be. A mérés 0,32 mikrométer átlagos átmérőjű antifibrinogén-szilíciumdioxidrészecskék és standard fibrinogén-oldatok sorozatának alkalmazásával történt. A 9. ábra kalibrációs görbét szemléltet, s arra az időre vonatkozik, amely ahhoz szükséges, hogy 1,2 mikrométer hullámhosszúságon az extinkció 0,5 értéket érjen el. A méréshez antifibrinogénnel érzékenyített latexreagenst különböző koncentrációjú standard fibrinogén-oldatokkal reagáltattunk. A 10. ábrán 1,2 mikrométer hullámhosszon felvett extinkciós kalibrációs görbe látható. A görbe meghatározásához oxitocin-antiszérumot reagáltattunk különböző koncentrációjú standard oxitocin-oldatokkal, majd a reakcióelegyhez latex-részecskéket adtunk, amelyeket az oxitocin érzékenyített. A 11. ábrán egy 1,0 mikrométernél meghatározott extinkciós kalibrációs görbét tüntettünk fel, amelyet úgy kaptunk, hogy anti/humán chorion-gonadotropin/-szérumot humán chorion-gonadotropin különböző koncentrációjú standard oldataival reagáltattunk, majd a kapott reakcióelegyhez humán chorion-gonadotropinnal érzékenyített latex-részecskéket adtunk. A 12. ábra a kimutatás érzékenységének az antifibrinogénnel érzékenyített polisztirol-latex koncentrációjával való változását mutatja. A 13. ábra a humán immunglobulin E extinkciós kalibrációs görbéjét szemlélteti, amely a 0,94 mikrométer hullámhosszúságú fény alkalmazásával mért extinkció változását adja meg a standard humán immunglobulin E-oldat mikrogramm/ml egységben kifejezett koncentrációja függvényében. A 14. ábra az inzulin extinkciós kalibrációs görbéjét mutatja be. A 15. ábrán a humán chorion-gonadotropin béta-alegysége extinkciós kalibrációs görbéje látható. Például az 1. ábrán a fény hullámhosszát az abszcisszára, a fény százalékos átbocsátását pedig az ordinátára vittük fel, és a görbe 1 mm vastagságú vízréteg százalékos átbocsátási spektrumát szemlélteti a 0,6—2,4 mikrométer közötti hullámhossz-tartományban. Az 1. ábráról leolvasható, hogy a 0,6—1,4 mikrométer hullámhosszúságú fény gyakorlatilag számottevő abszorpció nélkül áthatol a vízen, amely egyébként a latexek és a minták számára a legkiterjedtebben alkalmazott alapközeg. Az 1,53—1,88 mikrométer közötti hullámhosszúságú fény szintén lényegében áthatol, úgy, hogy az ebbe a hullámhossz-tartományba eső fény alkalmazható a találmány szerinti eljáráshoz. Látható továbbá az 1. ábrán, hogy a 2,1-2,35 mikrométer hullámhosszúságú fénynek csupán Wntegy 20%-át engedi át a víz, ezért az ilyen fény alkalmazásakor — ami egyébként nem előnyös — nagy érzékenységű fotométer használata szükséges. A 2. ábra 1 súly% szilárdanyag-tartalmú polisztirol-latex extinkciója (ordináta) és a fény hullámhossza (abszcissza, mikrométerben) közötti összefüggést mutatja, 2 mm vastagságú abszorpciós követte alkalmazásakor. Az A görbe 0,481 mikrométer átlagos átmérőjű részecskékből álló polisztirol-latex extinkciójának változását, a B görbe pedig 0,804 mikrométer átlagos részecskeátmérőjű polisztirol-latex extinkciójának változását ábrázolja. Az extinkció meghatározásához _ előnyösen hígítjuk a latexet, s a leolvasott extinkció-érték és a hígítás szorzatát tekintjük a latex extinkciójának. A 2. ábráról kitűnik, hogy a latex extinkciója 0,6 mikrométer alatti hullámhosszon erősen növekszik, és ezért ilyen hullámhosszúságú fény használatakor nehezen határozhatók meg az antigén-antitest reakcióelegy fényátbocsátásának változásai. Ha viszont legalább 0,8 mikrométer, célszerűen legalább 1 mikrométer hullámhosszúságú fénnyel dolgozunk, akkor a latexnek, az extinkciója viszonylag csekély. Ezért legalább 0,8 mikrométer, célszerűen pedig legalább 1 mikrométer hullámhosszúságú fényt alkalmazunk a találmány szerint a fényátbocsátás fentebb említett méréséhez. A 2. ábra A és B görbéjének összehasonlításából megállapíthatjuk, hogy a latex extinkciója növekszik a polisztirol-latex-részecskék átlagos átmérőjének növekedésével. Ennek következtében a rendkívül nagy átlagos átmérőjű latex-részecskék nem alkalmasak a találmány szerinti eljáráshoz. Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a találmány szerinti eljáráshoz alkalmas, oldhatatlan hordozórészecskék átlagos vagy közepes részecskeátmérője legfeljebb 1",6 mikrométer. Előnyösek a 0,1—1 mikrométer közötti átlagos átmérőjű latex-részecskék. Különösen előnyösek a 0,2—0,8 mikrométer közötti átmérőjű részecskék. A 3. ábra összefüggést ad meg egy antigén-antitest reakcióelegynek az ordinátára felvitt extinkciója és az alkalmazott fény hullámhosszúsága között — ez utóbbit az abszcisszán tüntettük fel mikrométerben —, különböző reakcióidőkben. Az antigén-antitest reakciót pontosan az 1. példában ismertetésre kerülő módon végeztük, mindössze azzal az eltéréssel, hogy 0,234 mikrométer átlagos részecskeátmérőjű polisztirol-latexet alkalmaztunk. A 3. ábrán látható C, D és E görbe a reakcióelegy extinkcióját szemlélteti, 3, 10 illetve 20 perccel az antigén-antitest reakció kezdete után. 3. ábráról leolvasható, hogy abban az esetben, ha az antigén-bitest reakcióelegy extinkcióját 0,6 mikrométernél rövidebb hullámhosszúságú, körülbelül 0,4—0,6 mikrométer közötti hullámhosszúságú fénnyel határozzuk meg, az extinkció változás nem alkalmas a reakció követésére, és körülbelül 0,4 mikrométernél nem nagyobb hullámhosszúságú fény alkalmazásakor az extinkció egyáltalában nem változik észrevehetően a reakció előrehaladásával. Másrészt, legalább körülbelül 0,75 mikrométer hullámhosszúságú fény alkalmazásakor igen jó összefüggés áll fenn a reakcióelegy extinkciója és a reakcióidő között. A 3. ábra C, D és E görbéjén szaggatottan megadott tartományokban az extinkció még nagyobb résszélesség alkalmazásakor sem határozható meg pontosan, mivel a viz fényabszorpciója igen nagy ezekben a tartományokban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
