176294. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének és antitestek meghatározására
27 176294 28 (3) Kalibrációs görbe felvétele Műanyag kémcsőbe bemérünk 0,2 ml olyan oldatot, amelyet a (2) pontban alkalmazott oxitocin-antiszérum 30-szoros hígításával kaptunk. Hozzáadunk 0,1 ml standard oxitocin-oldatot, amely 0,1 N vizes ecetsavval készült, és koncentrációja a XII. táblázatban látható. Az elegyet jól összekeverjük, majd 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Hozzáadunk 0,1 ml, oxitocinnal érzékenyített és az (1) pont szerint készített latex-reagenst, s a kapott elegyet 12 percig rázatjuk percenként 200 rázatást végző rázógépen. Az ilyen módon kapott folyadékot 2 mm szélességű üveg fényabszorpciós küvettába öntjük, és meghatározzuk az extinkcióját 1,2 mikrométer hullámhosszúságú fény alkalmazásával az 1. példa (2) pontjában leírt módon. A különböző koncentrációjú standard oxitocin-oldatokkal kapott eredményeket a XII. táblázat tartalmazza. XII. Táblázat A standard oxitocin-oldat koncentrációja, pNE/ml Extinkció 1,2 pm-nél AD* 2 000 0,395 0,183 1 500 0,450 0,128 1 000 0,483 0,095 500 0,525 0,053 300 0,550 0,028 0 0,578 — +A D = a zérus koncentrációjú standard oxitocin-oldat extinkciójának és a megadott koncentrációjú standard oxitocin-oldat extinkciójának különbsége. Ha a XII. táblázatban szereplő adatokat grafikusan ábrázoljuk, és a standard oxitocin-oldat koncentrációját az abszcisszára, ■ a A D-értéket pedig az ordinátára visszük fel, lineáris összefüggéshez jutunk, mint az a 10. ábrán látható. Az ilyen módon kapott kalibrációs görbe alkalmazásával meghatározhatjuk terhes nők vérszérumában az oxitocint. 8. példa (1) Humán chorion-gonadotropinnal érzékenyített latex-reagens előállítása 5 ml 0,05 N sósavban feloldunk 7900 NE/ml humán chorion-gonadotropint, és az anyagot 1 órán át hidrolizáljuk 80 °C-on. Ezután az oldatot dializáljuk, szívatással szűrjük, és a kapott, hidrolizált humán chorion-gonadotropint 2 ml 0,05 M 8,7pH-értékű borát-pufferoldatban oldjuk, és 10 ml térfogatra hígítjuk. Részletekben, keverés közben hozzáadunk 5 ml 2%-os polisztirol-latex-oldatot (szilárdanyag-tartalma 10súly%, gyártó Dow Chemical Co.), amelyben a részecskék átlagos átmérője 0,481 mikrométer. A kapott, humán chorion-gonadotropinnal érzékenyített latex-részecskéket 20 percig centrifugáljuk 13 000/perc fordulatszámon, az érzékenyített latex-részecskéket elkülönítjük, és 0,2% marhaszérum-albumint tartalmazó 10 ml borát-pufferoldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziót centrifugáljuk, a csapadékot a ' borát-pufferoldattal történő centrifugálással mossuk, és végül 10 ml puffer-oldatban szuszpendáljuk. Ilyen módon 1 súly% latex-részecskéket tartalmazó, humán chorion-gonadotropinnal érzékenyített latex-reagenst kapunk. (2) Kalibrációs görbe felvétele Az anti-(humán chorion-gonadotropin)-szérum optimális koncentrációját a 7. példa (2) pontjában leírt módon határozzuk meg (ebben az esetben az 300-szoros hígításnak felel meg). Ezután műanyag kémcsőben bemérünk 0,2 ml anti-(humán chorion-gonadotropin)-szérum-oldatot, amelyet a szérum fiziológiás nátriumklorid-oldattal történő 300-szoros hígításával kapunk, hozzáadunk 0,1 ml standard humán chorion-gonadotropin-oldatot, amelynek a koncentrációja a XIII. táblázatban látható, és az elegyet 10 percig rázatjuk. Ezután hozzáadunk 0,1 ml, humán chorion-gonadotropinnal érzékenyített latex-reagenst (amelyet a fenti (1) pont szerint állítunk elő), és az elegyet 10 percig rázatjuk percenként 200 rázatással. A kapott folyadékot 2 mm szélességű üveg abszorpciós küvettába öntjük, és meghatározzuk az extinkcióját az 1. példa (2) pontjában megadott módon 1,0 mikrométer hullámhosszúságú fény alkalmazásával. A kapott eredményeket a XIII. táblázatban foglaljuk össze. XIII. Táblázat A standard humán chorion-gonadotropin - -oldat koncentrációja, NE/ml Extinkció 1,0 pm-nél 10 0,140 1 0,208 0,1 0,271 Ha a táblázatban szereplő számértékeket grafikusan ábrázoljuk, mégpedig a standard humán chorion-gonadotropin-oldat koncentrációjának logaritmusát az abszcisszán, az extinkciót pedig az ordinátán, a 11. ábrán bemutatott kalibrációs görbét kapjuk. Ez a kalibrációs görbe lineáris lefutású azokban a koncentráció-tartományokban, amelyekben a mérés ténylegesen történik. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
